Automated HILiC-MS/MS Method for Therapeutic Drug Monitoring of Aminoglycoside Antibiotics and Vancomycin

Význam tématu

Aminoglykosidy a glykopeptid vancomycin jsou klíčovými antibiotiky při léčbě závažných infekcí vyvolaných gramnegativními baktériemi a rezistentními kmeny. Jejich užití je však omezeno úzkým terapeutickým oknem a vysokou nefrotoxicitu. Terapeutické monitorování (TDM) koncentrací těchto látek v plazmě je proto nepostradatelné pro optimalizaci dávkování a snížení nežádoucích účinků. Klasické imunotesty vykazují omezenou specificitu, křížové reakce a vysoké náklady na multiplexní analýzu, zatímco LC-MS/MS nabízí vyšší selektivitu, citlivost a možnost současného sledování více sloučenin.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované studie je vývoj a validace plně automatizované metody HILiC-MS/MS s přímým připojením přístroje pro přípravu vzorků, která umožní simultánní kvantifikaci sedmi aminoglykosidů (amikacin, gentamiciny C1, C1a, C2, kanamycin, neomycin B, paromomycin, tobramycin, arbekacin) a vancomycinu v lidské plazmě. Metoda byla navržena tak, aby splňovala požadavky klinických laboratoří na rychlost, přesnost a robustnost pro rutinní TDM.

Použitá metodika a instrumentace

Automatizovaná příprava vzorku byla realizována na zařízení CLAM™-2000, které zabezpečuje precipitaci proteinu trichloroctanem, filtraci a přímý přenos eluátu do autosampleru.

Chromatografie:

• Systém: Nexera X2 UHPLC
• Kolona: GL Sciences InertSustain Amide 3 µm, 50 × 2,1 mm
• Teplota: 50 °C
• Mobilní fáze A: voda s 250 mM síranem amonným a 1 % kyselinou mravenčí
• Mobilní fáze B: acetonitril
• Gradient: 75 % B (0,2 min) → 55 % B (1,3 min) → návrat na 75 % B (celkem 4,75 min běhu)
• Průtok: 400 µL/min, injekční objem 0,5 µL

Hmotnostní spektrometrie:

• Přístroj: LCMS-8060 (triple quadrupole)
• Ionizace: HESI+, +5 kV
• Teploty: interface 300 °C, DL 150 °C, blok 500 °C
• Plnicí plyny: nebulizační 2,5 L/min, ohřívací 10 L/min, sušící 3 L/min
• MRM přechody pro každý analyzát s dwell time 23 ms, pause time 1,5 ms
• Interní standard: hygromycin B (50 µg/mL)

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrační křivky v rozsahu 0,1–50 µg/mL (0,1–100 µg/mL pro vancomycin, 0,1–30 µg/mL pro arbekacin) vykazovaly koeficient determinace R² ≥ 0,997. Recovery celkové metody se pohybovalo mezi 89–105 %, což dokládá efektivní extrakci a minimální matrix effect. Precision (RSD) byla <15 % (LOQ <20 %) a accuracy se pohybovala v rámci 80–120 % ve všech QC úrovních. Celková doba analýzy <5 min zajišťuje vysoký laboratorní throughput.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Simultánní kvantifikaci osmi antibiotik ve jednoznačně ověřené selektivitě
• Minimalizaci rušivých vlivů plazmatické matrice
• Automatizaci přípravy vzorků a online integraci s UHPLC-MS/MS
• Rychlý cyklus analýzy vhodný pro vysokoprodukční klinické laboratoře

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit o další lékově důležité antibiotika či metabolity, optimalizovat pro miniaturizované platformy a digitalizované laboratorní workflow. Integrace s LIMS a kontinuální monitorování stability přístrojového systému otevře dveře pro real-time TDM a výzkum farmakokinetiky.

Závěr

Vyvinutá automatizovaná HILiC-MS/MS metoda pro TDM aminoglykosidů a vancomycinu prokázala vysokou přesnost, reprodukovatelnost a robustnost. Díky výraznému zkrácení doby analýzy a plné automatizaci přípravy vzorků je plně kompatibilní s provozními požadavky klinických laboratoří.

Reference

• LEVI M., KAWAKAMI D., WATANABE J. Automated HILiC-MS/MS Method for Therapeutic Drug Monitoring of Aminoglycoside Antibiotics and Vancomycin. Shimadzu Corporation, Kyoto, 2023.