High-Throughput Single Cell Proteomics Analysis with Nanodroplet Sample Processing, Multiplex TMT labeling, and Ultra-Sensitive LC-MS

Význam tématu

Analýza proteomu jednotlivých buněk je klíčová pro pochopení buněčné heterogenity a identifikaci vzácných buněčných populací v biomedicínském výzkumu. Metody založené na hmotnostní spektrometrii (LC-MS/MS) umožňují nezaslepenou identifikaci a kvantifikaci tisíců proteinů z velmi malých vzorků, což otevírá nové možnosti v oblasti diagnostiky, farmaceutického vývoje a základního výzkumu.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl vyvinout vysoce propustnou a citlivou metodu pro analýzu proteomů jednotlivých savčích buněk. Autoři spojili unikátní platformu nanoPOTS pro přípravu mikroobjemných vzorků s izobarickým multiplexním značením TMT a vysoce výkonnou analýzou na Orbitrap Eclipse Tribrid se systémem Real-Time Search. V rámci experimentu bylo zpracováno celkem 40 jednotlivých buněk tří různých buněčných typů (epiteliální, endoteliální a primární imunitní buňky).

Použitá metodika a instrumentace

Pracovní postup zahrnoval následující kroky:

• Izolace singlů fluorescenčně aktivovanou buněčnou třídící (FACS) analýzou do nanoPOTS čipů.
• Denaturace, redukce, alkylace a tryptická digestace buněčných proteinů v nanodropletech (<0,2 ng proteinů).
• Multiplexní značení TMT10plex reagenty a kombinace vzorků s boost vzorkem (5 ng) pro zvýšení signálu.
• Separační LC v režimu low-nanoflow na systému UltiMate 3000 RSLCnano (30 µm i.d., 30 cm kolona, 20 nL/min).
• Analýza na Orbitrap Eclipse Tribrid MS s MS2 i SPS MS3 metodami a aktivací Real-Time Search pro zlepšení proteomového pokrytí a kvantitativní přesnosti.
• Vyhodnocení dat v softwaru Proteome Discoverer 2.4.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila identifikaci až 2346 proteinových skupin a kvantifikaci přibližně 1300 proteinů ze 40 jednotlivých buněk. Princip multiplexního TMT značení a Real-Time Search vedl k:

• Jasné diferenciaci tří buněčných typů na základě heatmapy a PCA analýzy.
• Zvýšení počtu identifikovaných proteinů a peptidových skupin při použití SPS MS3 oproti standardní MS2.
• Zlepšení kvantitativní reprodukovatelnosti a přesnosti bez výrazného kompromisu ve výtěžku identifikací.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená platforma nabízí:

• Vysokou propustnost a robustnost pro zpracování velmi malých biologických vzorků.
• Možnost systematického studia buněčné heterogenity a vzácných populací (např. cirkulujících nádorových buněk).
• Využití v QA/QC laboratořích, výzkumu kmenových buněk a analýze klinických vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry dalšího rozvoje:

• Rozšíření multiplexního značení až na 16plex pro vyšší propustnost.
• Integrace s dalšími omickými přístupy a prostorovou proteomikou pro studium tkáňové heterogenity.
• Využití AI-řízených algoritmů pro automatizovanou analýzu dat a identifikaci biomarkerů.

Závěr

Platforma nanoPOTS ve spojení s multiplexním TMT značením a Orbitrap Eclipse Tribrid s Real-Time Search představuje průlom v oblasti single-cell proteomiky. Metoda dosahuje vysoké citlivosti, reprodukovatelnosti a throughput, což ji předurčuje pro široké spektrum aplikací od základního výzkumu po klinické studie.

Reference

1. Zhu Y. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 57, 12370 (2018)
2. Budnik B. et al. Genome Biol. 19, 161 (2018)
3. Brian K. E. et al. J Proteome Res. 18, 1299 (2019)