Multiplexed protein quantification using the isobaric TMT method: Improving reproducibility and protein coverage with PD 2.1

Význam tématu

Metoda izobarického značení TMT umožňuje současné kvantitativní porovnání až deseti vzorků v jednom experimentu, což zvyšuje efektivitu a snižuje variabilitu měření. Přesná a reprodukovatelná kvantifikace proteinů je klíčová pro výzkum biochemických drah, biomarkerů a farmakologických studií.

Cíle a přehled studie

Prezentace popisuje zásadní vylepšení kvantifikačního workflow v Proteome Discoverer 2.1 oproti předchozím verzím. Cílem je zvýšit pokrytí proteinů, zlepšit reprodukovatelnost dat a zpřehlednit uživatelské rozhraní.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda vychází z Gygiho postupu:

• Stanovení poměru signál/šum (S/N) pro každý reporter ion ve spektrech MS3.
• Filtrování peptidů podle míry interference a S/N prahu.
• Sčítání S/N hodnot z peptidů pro úroveň proteinů.
• Normalizace na celkový signál peptidů nebo na vybraný referenční protein.
• Škálování kanálů tak, aby průměrná hodnota činila 100 %, usnadňující barevná zobrazení a interpretaci.

Instrumentace: Orbitrap Fusion s metodou TMT SPS-MS3, vysoké rozlišení Orbitrap detektoru, nano-LC separace.

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace prahů S/N zvýšila přesnost kvantifikace nezávisle na absolutní intenzitě signálu. Nové možnosti normalizace a škálování poskytují flexibilitu při zpracování dat různých dimenzí multiplexu. Uživatelé mohou volit mezi zobrazením součtů S/N, škálovaných abundancí nebo přímo poměrů.
Praktické ověření na experimentu s dixotickou posunovou kulturou kvasinek prokázalo identifikaci přes 4700 proteinů a více než 88 000 peptidů. Analýza klastrováním odhalila biologicky významné vzory změn abundancí, například zvýšení proteinů TCA cyklu po vyčerpání glukózy.

Přínosy a praktické využití metody

• Vážené zahrnutí vysoce intenzivních peptidů snižuje vliv odlehlých hodnot.
• Sčítané S/N tolerantní k chybějícím datům, bez nekonečných nebo nulových poměrů.
• Vylepšené uživatelské rozhraní zrychluje nastavení korekčních faktorů a poměrů.
• Možnost zařazení "razor" peptidů zvyšuje pokrytí proteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj směruje k automatizaci výpočtů a integraci s pokročilou statistickou analýzou a strojovým učením. Očekává se rozšíření multiplexních kitů nad deset kanálů a širší aplikace ve farmaceutickém výzkumu, klinické proteomice a biofarmaceutické kvalitě.

Závěr

Proteome Discoverer 2.1 přináší nejspolehlivější kvantitativní výsledky v prostředí TMT kvantifikace díky optimalizovaným S/N prahům, flexibilním normalizačním strategiím, škálování abundancí a přehlednému UI. Tím se zvyšuje reprodukovatelnost i proteomické pokrytí.

Reference

Rosa Viner. Multiplexed protein quantification using the isobaric TMT method: Improving reproducibility and protein coverage with PD 2.1. HUPO 2015.