An Ultra Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry Method for the Analysis of Non-derivatized Gentamicin Components

Význam tématu

Gentamicin je širokospektré aminoglykosidové antibiotikum bez chromoforů, které se skládá ze směsi strukturálně blízkých analogů C1, C1a, C2 a C2a lišících se úrovní methylace a toxicitou. Přesná analýza jednotlivých komponent je zásadní pro zajištění bezpečnosti pacientů a splnění regulatorních požadavků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou UPLC–MS metodu pro separaci neodvozených gentamicinových komponent pomocí systému ACQUITY UPLC H-Class Plus, kolony Atlantis Premier BEH Z-HILIC a detektoru QDa. Metoda byla ověřena na očních roztocích gentamicinu a testována s ohledem na reprodukovatelnost mezi různými šaržemi kolony.

Použitá metodika a instrumentace

• UPLC systém: ACQUITY UPLC H-Class Plus se 250 µL mixérem
• Kolona: Atlantis Premier BEH Z-HILIC 1,7 µm, 2,1 × 100 mm při 55 °C
• Mobilní fáze A: 80 mmol/l amonium formiát ve vodě (pH ~6,3); B: 0,1 % formic acid v ACN
• Isokratické složení: 48 % A / 52 % B; průtok 0,8 ml/min; injekce 3 µl
• Teplota vzorku: 5 °C
• MS: QDa v režimu pozitivní ionizace, m/z 300–630; kapilární napětí 0,8 kV; teplota sondy 600 °C; kužel 12 V
• Software: Empower 3

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimální poměr mobilních fází 48 % vodné fáze a 80 mmol/l amonium formiátu poskytl ostré, úzce elutující peaky s rozlišením >1,39.
• Isokratický běh trvající 10 min umožňuje rychlou reekvilibraci a vysokou propustnost vzorků.
• Metoda vykazuje výbornou reprodukovatelnost: RSD retenčních časů <1 %, RSD plochy <5 %.
• Test mezi šaržemi kolony potvrdil konzistentní výsledky (RSD ploch <10 %, retention time <1 % RSD).
• Analýza komerčních očních roztoků prokázala separaci benzalkonia a všech čtyř gentamicinových komponent.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nevyžaduje derivatizaci ani fluorované párovací činidlo, čímž se minimalizuje útlum v MS a znečištění přístroje. Isokratický režim zajišťuje rychlou a reprodukovatelnou analýzu. Konfigurace je snadno adaptovatelná i pro další aminoglykosidy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na širší panel aminoglykosidů s minimálními změnami parametrů.
• Integrace s vysoce výkonnými MS systémy pro zvýšení citlivosti a selektivity.
• Další optimalizace povrchových úprav kolony pro lepší stabilitu a nižší nevázané interakce.

Závěr

Navržená UPLC–MS metoda poskytuje rychlou, jednoduchou a reprodukovatelnou separaci neodvozených gentamicinových komponent bez nutnosti derivatizace či párovacích činidel. Metoda je vhodná pro rutinní kontrolu kvality a může být snadno implementována v analytických laboratořích.

Reference

1. Kobayashi M. et al. Comparisons of Cochleotoxicity Among Three Gentamicin Compounds. Acta Oto-Laryngologica, 2008;128(3):245–249.
2. Wohlfart J., Holzgrabe U. Analysis of Histamine and Sisomicin in Gentamicin. Arch Pharm, 2021;354(12):e2100260.
3. Kumar P. et al. Hydrophilic Interaction Chromatography for Aminoglycosides. J Sep Sci, 2012;35(4):498–504.
4. Stypulkowska K. et al. Determination of Gentamicin Sulphate Composition by LC. Chromatographia, 2010;72:1225–1229.
5. White L.O. et al. Variations in Gentamicin Content by HPLC. Ther Drug Monit, 1983;5(1):123–126.
6. Wei J. et al. Selective Separation of Aminoglycosides on Zwitterionic Column. J Sep Sci, 2014;37(14):1781–1787.
7. Alkhateeb F.L. et al. Separation and Quantification of Aminoglycosides Using LC–MS. Waters Application Note, 2022.
8. McMaster J., Wiley M.C. Solvents and Volatile Buffers for LC/MS. LC/MS: A practical user's guide, 2005;139–140.