Validated Method for the Determination of Phenylbutazone in Horse Meat with LC-MS/MS

Význam tématu

Phenylbutazon (PBT) patří mezi široce používané nesteroidní protizánětlivé léky u veterinárních pacientů, zejména koní. Nevhodné nebo nezákonné podání PBT u koní určených ke spotřebě představuje zdravotní riziko pro člověka. Evropská legislativa proto vyžaduje spolehlivou metodu pro detekci a kvantifikaci stopových reziduí PBT v mase.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout a interně validovat vysoce citlivou LC-MS/MS metodu pro stanovení PBT v koňském mase s LOQ pod 5 µg/kg, splňující požadavky Evropské komise pro rutinní monitoring nelegálních reziduí.

Použitá metodika a instrumentace

Postup zahrnuje:

• vážení 2 g homogenizovaného vzorku koněcího masa a přidání 20 ppb izotopového interního standardu,
• enzymatickou hydrolýzu (β-glukuronidáza, pH 4,5, 37 °C, 1 h),
• extrakci acetonitrilem, centrifugaci a opakovanou extrakci,
• odmaštění na silikagelovém SPE, koncentraci eluátu,
• čistění na C18 SPE, eluci acetonitrilem, vysušení a rekonstituci v mobilní fázi,
• UHPLC separaci na Accucore C18 (50 × 2,1 mm, 2,6 µm) s gradientem 0,1 % formic acid/voda – acetonitril a SRM detekci na Thermo TSQ Vantage ve HESI negativním režimu.

Klíčové přístroje:

• UltiMate 3000 UHPLC
• TSQ Vantage triple quadrupole MS
• Accucore C18 kolona
• HyperSep Silica a C18 SPE cartrdiges

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda vykázala:

• linearitu 0–30 µg/kg (R2 = 0,9941),
• spolehlivé LOQ 2,0 µg/kg a LOD 0,8 µg/kg,
• recovery 95,6–103,9 % a opakovatelnost (RSD) 2–6 % intraday, 9,8 % mezi dny,
• CCα a CCβ stanovené na 1,00 a 1,29 µg/kg,
• absenci významného matrix efektu (slope y = 0,9821x),
• robustnost potvrzenou opakováním na jiné LC-MS/MS soustavě a jiným operátorem.

Přínosy a praktické využití metody

Díky vysoké citlivosti a selektivitě metody lze rutinně monitorovat nelegální používání PBT u koní určených ke spotřebě. Dvouúrovňové SPE čištění minimalizuje matrix interferenci a umožňuje přesné kvantifikace i při nízkých koncentracích pod akčním limitem 5 µg/kg.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• multiplexní screening dalších veterinárních liečiv v jednom běhu,
• plná automatizace extrakčního a SPE kroku pro vysokopropustné laboratoře,
• implementace vysokorychlostní UHPLC a QTOF/Q-Orbitrap pro neznámé rezidua,
• rozšíření na jiné živočišné matrixy (mléko, játra) a potravinové produkty.

Závěr

Vyvinutá a interně validovaná LC-MS/MS metoda pro stanovení phenylbutazonu v koňském mase splňuje legislativní požadavky EU, nabízí vysokou citlivost, přesnost a robustnost. Je vhodná pro rutinní kontrolní programy zajišťující bezpečnost potravin.

Reference

1. Commission Decision 2002/657/EC.
2. Jedziniak P. et al. Anal. Chim. Acta 2010, 672, 85–92.
3. ISO 11843: Capability of detection, 1997.
4. Merck Veterinary Manual: bute pharmacology overview.