Improved Top-Down Sequence Coverage on an Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer by Ion-Ion Proton Transfer (IIPT) Reactions Subsequent to ETD and UVPD

Význam tématu

Metody pro analýzu intactních proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie hrají klíčovou roli v proteomice. Top-down přístup se snaží identifikovat strukturu celého proteinu místo štěpení na peptidy, ale trpí komplikacemi kvůli vysoké složitosti spekter. Zlepšení pokrytí sekvence umožňuje detailnější charakterizaci posttranslačních modifikací a izoform, což je nezbytné pro výzkum i průmyslové aplikace.

Cíle a přehled studie

Tato studie hodnotí nové schéma ion-ion proton transfer (IIPT) aplikované po aktivaci elektronovým přenosem (ETD) nebo UV fotodissociací (UVPD) na Orbitrap Fusion Lumos. Cílem je snížit hustotu fragmentů v MS2 spektru a rozptýlit je do širšího m/z rozsahu pomocí selektivní reaktivace vybraných oken fragmentů, čímž se dosáhne vyššího pokrytí proteinové sekvence.

Použitá metodika a instrumentace

• Mass spectrometr: Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid
• Aktivační metody: ETD a UVPD
• Reagent: perfluoroperhydrophenanthrene (623 m/z) pro IIPT
• Data dekonvoluce: Hardklör2 a Xtract
• Identifikace sekvence: ProSight Lite (10 ppm tolerance)

Hlavní výsledky a diskuse

Aplikace IIPT na vybraná okna MS2 fragmentů významně snížila překryv izotopických klastrů a rozptýlila fragmenty do širšího m/z rozsahu. Optimalizací počtu a šířky oken se u bovinní karbonanhydrázy dosáhlo nárůstu sekvenčního pokrytí z 54 % na 68 % a zvýšil se počet přiřazených fragmentů až o 30 %. Zlepšila se také kvalita spekter díky vyššímu poměru signál/šum.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená šance na identifikaci posttranslačních modifikací a izoform
• Efektivní analýza proteinů s vysokou molekulovou hmotností
• Aplikace v QA/QC v biotechnologiích a farmaceutickém průmyslu

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace IIPT s dalšími sekvenačními přístupy a umělou inteligencí může dále zlepšit automatizaci a rychlost analýzy. Vývoj nových reagentů a optimalizace reaktorových podmínek otevřou cestu k hlubší charakterizaci komplexních proteomických vzorků. Zvýšení paralelizace a spojení s mikrodělícími systémy podpoří vysokopropustné analýzy.

Závěr

Přidání IIPT reakcí po ETD a UVPD na Orbitrap Fusion Lumos významně zlepšilo sekvenční pokrytí intactních proteinů. Metoda nabízí robustní přístup k detailní top-down analýze, zvyšuje kvalitu spektrálních dat a rozšiřuje možnosti aplikace v proteomice.

Reference

1. Anderson LC, English MA, Wang WH, et al. Protein derivatization and sequential ion/ion reactions to enhance sequence coverage produced by electron transfer dissociation mass spectrometry. IJMS. 2015;377:717–624.
2. Hoopman MR, Finney GL, MacCoss MJ. High-speed data reduction, feature detection, and MS/MS spectrum quality assessment of shotgun proteomics data sets using high-resolution mass spectrometry. Anal Chem. 2007;79(15):5620–5632.