HILIC – an alternative separation technique for glycopeptides

Význam tématu

Hydrofobní interakce obrácené fáze (RP) nepostačují k účinnému rozlišení peptidových glykokonjugátů monoclonálních protilátek kvůli podobné hydrofobitě. HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) využívá rozdílů hydrofilicity mezi peptidy a glykokonjugáty, což umožňuje separaci glykokonjugátů s vysokou rozlišovací schopností a opakovatelností. Tento přístup je klíčový pro charakterizaci glykanového profilu bioterapeutik, který ovlivňuje jejich účinnost a bezpečnost.

Cíle a přehled studie

Demonstrace vhodnosti UHPLC systému Thermo Scientific Vanquish Flex spolu s kolonkou Accucore 150 Amide HILIC pro separaci tryptického digestu infliximabu obsahujícího peptidy i glykopeptidy v jednom běhu a ověření reprodukovatelnosti retencí glykokonjugátů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek infliximabu (10 mg/mL) byl trávěn SMART Digest kitem (70 °C, 45 min), redukován DTT a čistěn C18 spin columns. Pro separaci byla použita mobilní fáze A (90:10 acetonitril:voda, 10 mM amonný formiát) a B (10 mM amonný formiát, pH 4,4), gradient 10–60 % B/45 min (plný běh) nebo zkrácený program pro oblast glykopeptidů. Detekce probíhala UV (280 nm) a fluorescence (ex 280 nm, em 304 nm), identifikace struktur díky Q Exactive HF Orbitrap MS s HCD fragmentací. Data zpracováno v Chromeleon CDS a BioPharma Finder.

Použitá instrumentace

• Vanquish Flex UHPLC: Flex System Base, Quaternary Pump, Column Compartment H, Split Sampler FT (25/100 µL), DAD HL (LightPipe), FLD F (2 µL bio flow cell), Static Mixer.
• Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS s HESI-II zdrojem.
• SMART Digest kit, C18 spin columns, Accucore Amide 150 Å HILIC kolonka (2.1 × 150 mm, 2.6 µm), reagencie LC-MS grade.
• Software: Chromeleon 7.2 SR5, BioPharma Finder 2.0.

Hlavní výsledky a diskuse

Plný gradient umožnil separaci nenavázaných peptidů a čtyř hlavních glykoform (A2G0F, A2G1Fa, A2G1Fb, A2G2F) s retencemi 30,76–33,70 min. Retenční čas RSD <0,05 % a SD 0,013–0,017 min potvrdily vynikající reprodukovatelnost. Zkrácený gradient izoloval glykopeptidové pásmo mezi 7 a 17 min bez významné ztráty rozlišení. MS1/MS2 analýza potvrdila 18 glykopeptidových forem. Porovnání UV a FLD detekce ukázalo vyšší poměr signál/šum u FLD a homogenní odpověď na dvě tyrosiny v peptidu, což zlepšuje kvantifikaci nízkokoncentrovaných forem.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje robustní a vysoce reprodukovatelné rozlišení glykopeptidů mAb vhodné pro vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik. FLD umožňuje kvantifikaci i slabě zastoupených forem bez nutnosti MS detekce, zkrácený běh šetří čas a rozpouštědla a usnadňuje rutinní stabilitní studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metody na složitější glykoproteiny s více glykozilačními místy (N- a O-glykanů) s využitím middle-down MS přístupu nebo kombinovaného uvolněného N- a O-glykanového profilu. Integrace HILIC-FLD/UV-MS do automatizovaných QC platforem pro kontinuální monitorování glykoform během bioprocesu.

Závěr

UHPLC HILIC separace na kolonce Accucore Amide 150 Å ve spojení s Vanquish Flex systémem a UV/FLD detekcí poskytla vynikající rozlišení a retenční přesnost glykopeptidů infliximabu. Tato metoda je snadno přenositelná do rutinních QA/QC aplikací a nabízí zkrácené analýzy s vysokou citlivostí a kvantitativní spolehlivostí.

Reference

1. AN 1123: Increased Long-term Stability of Peptide Mapping using the Vanquish UHPLC System. 2015.
2. EMA: Approval of first two monoclonal-antibody biosimilars. 2013.
3. ICH Q6B Guideline: Characterisation of Biotechnological/Biological Products. 1999.
4. EMA Guideline on similar biological medicinal products. 2014.
5. AN 1132: Reliable results in Peptide Mapping using the Vanquish Flex UHPLC system.
6. AN 1134: LC-UV-MS Vanquish Flex Peptide Mapping Development for QA/QC.