High-Throughput LC-MS/MS Quantification of Estrone (E1) and Estradiol (E2) in Human Blood Plasma/Serum for Clinical Research Purposes

Význam tématu

Stanovení steroidních hormonů estronu (E1) a estradiolu (E2) v krevní plazmě či séru je klíčové pro výzkum reprodukční biologie, endokrinologie a klinické monitorování hormonálních dysbalancí. Přesné a citlivé kvantifikace v rozsahu jednotek pg/mL umožňují sledovat fyziologické a patologické změny v hladinách estrogenu, podporují vývoj nových léčebných strategií a validaci biomarkerů v klinickém výzkumu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout robustní, rychlou a vysoce propustnou metodu LC-MS/MS pro kvantifikaci E1 a E2 v lidské krevní plazmě/seru v analytickém rozsahu 5–500 pg/mL. Studie hodnotila linearitu, přesnost, opakovatelnost, matrixové efekty, přenositelnost výsledků a srovnání s referenční laboratoří.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: 200 µl séra, přídavek deuterovaného E2 (E2-D5) jako interního standardu.
Extrakce: kapalná extrakce metyl-t-butyl éterem, sušení dusíkem.
Derivatisace: dansylchlorid pro tvorbu pozitivně nabitých derivátů estrogenů.
Chromatografie: multikanálový HPLC Thermo Transcend LX-4, kolona Accucore RP-MS (2,6 µm, 50 × 2,1 mm) při 40 °C, mobilní fáze voda + 0,1 % kyseliny mravenčí (A) a methanol (B), gradientní eluce za 5,5 min.
Hmotnostní spektrometrie: triple kvadrupól Thermo TSQ Endura s HESI probe, pozitivní režim SRM, optimalizované přechody Q1→Q3 pro kvantifikaci a potvrzení E1, E2 a IS.
Software: Thermo TraceFinder pro zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární rozsah a citlivost:

• 5–500 pg/mL (18,5–1850 pmol/L) pro E1 i E2, linearita r2 ≥ 0,995 při 1/X vážení.
• Limit kvantifikace 5 pg/mL.

Opakovatelnost a přesnost:

• Intra-batch CV < 6 %, inter-batch CV < 7 %.
• Procházení analyzátoru (carryover) < 0,5 %.

Matrixové efekty:

• Průměrné plochy IS v kalibrátorech a QC ~143 000 cps (RSD 11 %), ve vzorcích 46 000–72 000 cps, průměrná zotavitelnost 37 %.
• Interní standard úspěšně kompenzuje matrixové vlivy.

Srovnání metod:

• 40 donorských vzorků testováno paralelně s referenční laboratoří.
• 95 % výsledků se lišilo o maximálně 20 % pro E1 i E2.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysokou citlivost, výbornou přesnost a reprodukovatelnost, nízký carryover a vysoký průchod vzorků (až 40 injekcí/hodina na multikanálovém HPLC). Je vhodná pro klinický výzkum, farmacokinetické studie a validaci biomarkerů v rutinní laboratorní praxi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření na multiplexní analýzu dalších steroidů a hormonů, automatizace přípravy vzorků, integrace s datovými platformami pro vysokokapacitní screening a aplikace v personalizované medicíně. Vývoj citlivějších ionizačních technik či nových derivatizačních reagentů může dále zlepšit detekční limity.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda pro kvantifikaci estronu a estradiolu v lidské plazmě/seru je vysoce citlivá, přesná a propustná. Prokazuje vynikající linearitu, nízké matrixové interference a dobré skloubení s výsledky referenční laboratoře. Dodává spolehlivý nástroj pro klinický výzkum a rutinní analýzy hormonů.

Reference

1. Nelson R.E. et al. Liquid chromatography–tandem mass spectrometry assay for simultaneous measurement of estradiol and estrone in human plasma. Clin Chem. 2004;50:373–384.
2. Kushnir M.M. et al. High-sensitivity tandem mass spectrometry assay for serum estrone and estradiol. Am J Clin Pathol. 2008;129:530–539.