Fast Online Desalting of mAbs Using a Reversed-Phase Desalting Cartridge for LC-MS Analysis

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují klíčovou třídu bioterapeutik používaných v léčbě autoimunitních onemocnění, nádorů či kardiovaskulárních onemocnění. Pro vývoj a kontrolu kvality je nezbytné rychlé a spolehlivé stanovení hmotnosti intactních protilátek včetně jejich glykosylačních variant. On-line reverzněfázové odsolení před hmotnostní spektrometrií významně zvyšuje kvalitu spekter, zkracuje dobu analýzy a minimalizuje riziko kontaminace přístroje.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat rychlou (4min), plně automatizovanou metodu on-line odsolení intactních mAb (modelově rituximab) pomocí MSPac DS-10 cartridge a reverzněfázového UHPLC na Thermo Scientific Vanquish, následně spojenou s detekcí na Q Exactive Plus Orbitrap MS. Studie zahrnovala optimalizaci průtoku při naložení vzorku, gradientu, teploty i parametrů MS pro robustní stanovení hmotnostního spektra a glykosylace protilátek.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém: Thermo Scientific Vanquish (System Base, Binary Pump H, Split Sampler HT, Column Compartment H, odporový přídavný ohřev, 2-polohový/6-portový přepínací ventil, teplotní modul 70 °C).
• Desalting cartridge: Thermo Scientific MSPac DS-10 (2,1×10 mm), držák Acclaim Cartridge Holder.
• MS detekce: Thermo Scientific Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap s Ion Max HESI-II zdrojem.

Použitá metodika

Vzorek rituximabu (10 mg/mL) byl zředěn 1 000× v H2O/0,1 % HCOOH na konečných 10 µg/mL. Metoda se skládá ze tří fází: 1) naložení na cartridge při 0,5 mL/min (30 % B) a odsolení, divert na odpad, 2) lineární gradient 30→100 % B (0,2 mL/min) a divert na MS pro eluci intactního proteinu, 3) mytí a reequilibrace cartridge (100 % B, 1,0→0,5 mL/min). MS nastavení: m/z 1 800-5 000, rozlišení 17 500 při m/z 200, SID 20 eV, 10 microscans.

Hlavní výsledky a diskuse

• Odstranění solí a aduktů: MSPac DS-10 cartridge odstranila > 99 % neproteinových složek, což se projevilo čistým spektrálním profilem oproti konkurenčnímu C4 sloupci.
• Rychlost a propustnost: Kompletní cyklus analýzy 4 min umožňuje > 300 vzorků/den; reproducibilita spekter do 100 injekcí (10 ng) bez ztráty kvality.
• Glykosylační profil: Detekce minoritních glykoforem (< 1 %) u 100 opakovaných běhů s konzistentními poměry G0F, G1F, G2F aj.
• Naložení vysokých dávek: Při 1 000 ng naložení byla zjištěna nižší než 1 % stopa carryover po jediné blank analýze.

Přínosy a praktické využití metody

Prezentovaná on-line desaltingová metoda umožňuje rychlou a citlivou charakterizaci intactních mAb bez potřeby offline dialýzy či ultrafiltrace. Snížení meziproduktového zdržení, minimální carryover a robustní cartridge zvyšují propustnost při vývojových i rutinních QA/QC aplikacích ve farmaceutickém a biotechnologickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se, že integrace vysoce propustných odsolovacích kartridží s automatizovanými UHPLC-MS systémy pronikne i do oblastí proteomu, analýzy imunokonjugátů (ADC) a characterizace komplexních biomolekul. Dalším krokem bude miniaturizace (nano-LC-MS), využití vyššího rozlišení Orbitrapů a pokročilých dekonvolučních algoritmů pro zlepšení citlivosti a přesnosti kvantifikace low-abundance variant.

Závěr

MSPac DS-10 cartridge v kombinaci s Thermo Scientific Vanquish UHPLC a Q Exactive Plus MS poskytuje robustní, rychlou a reprodukovatelnou metodu on-line reverzněfázového odsolení intactních mAb. Metoda umožňuje detailní charakterizaci glykosylačních profilů v čase 4 min, nízké carryover i při vysokém zatížení a vysokou propustnost analytů ve vývojových i rutinních aplikacích.

Reference

1. Leavy O. Therapeutic antibodies: past, present, and future. Nature Reviews Immunology. 2010;10(5):297.