Improving Peptide Mapping Studies and Reducing Assay Failures Through Reproducible Performance Using the ACQUITY Premier UPLC System (BSM)

Význam tématu

V peptide mappingu je klíčové zajistit reprodukovatelnost chromatografického systému, protože přesné určení retenčních časů a tvaru píků přímo ovlivňuje kvalitu porovnání vzorků, identifikaci modifikací a spolehlivost metod v rámci vývoje i kontroly kvality biofarmaceutik.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo otestovat nový systém ACQUITY Premier UPLC vybavený Binary Solvent Managerem (BSM) a hybridními povrchy MaxPeak HPS. Hodnocena byla inter- a intrasystémová přesnost retenčních časů napříč devíti separačními podmínkami (tři průtoky a tři gradienty) a tvar píků pro vybrané peptidy náchylné k adsorpci na kovové povrchy.

Použitá metodika

• Vzorek: tryptický digest NIST mAb Reference Standard
• Devět chromatografických protokolů: průtoky 0,2; 0,35; 0,5 mL/min a gradienty 0,25; 0,5; 1 % B/min
• Trojnásobné injekce na třech samostatných systémech (celkem 27 injekcí)
• Vyhodnocení retenční doby: standardní odchylka normalizovaná na průměr v každé podmínce
• Vyhodnocení tvaru píků: výpočet USP tailing faktoru pro sedm kyselých a jednu základní peptidovou složku

Použitá instrumentace

• LC systém: ACQUITY Premier UPLC s Binary Solvent Managerem
• Detekce UV: ACQUITY Premier TUV, 214 nm, 10 mm průtoková kyveta
• MS detektor: ACQUITY QDa Mass Detector, pozitivní ionizace, rozsah 350–1250 m/z
• Kolona: ACQUITY Premier CSH C18 1,7 μm, 2,1 × 100 mm, teplota 60 °C
• Autosampler: udržování teploty vzorku na 8 °C, objem injekce 10 μL
• Software: Empower 3 FR 4

Hlavní výsledky a diskuse

Retenční časy všech 18 sledovaných peptidů vykázaly standardní odchylku menší než jedna sekunda napříč devíti podmínkami i třemi systémy. Histogram normalizovaných hodnot potvrzuje, že 95 % měření spadá do ±0,0114 min. Overlay chromatogramů ukazuje téměř totožné profily i pro extrémní podmínky (rychlý a pomalý gradient). MaxPeak HPS technologie snížila tailing faktor až o 83 %, což významně zlepšilo citlivost a umožnilo detekovat nízkoabundantní formy deamidovaných peptidů, které na standardních kolónách zůstaly skryté.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší mezipřístrojová a vnitropřístrojová přesnost retenčních časů
• Redukce nespecifické adsorpce peptidů a zkrácení tailingu přispívá k lepší citlivosti a kvantifikaci minoritních nečistot
• Rychlejší a spolehlivější přenos metod mezi laboratořemi bez potřeby manuálního dolaďování

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj funkcí bio-inertních povrchů pro minimalizaci interakcí analyty–povrchy, integrace ultra-high resolution MS pro identifikaci modifikací a automatizace datové analýzy pomocí umělé inteligence. Vývoj mikrofluidních separací a on-line spojení s HRMS podpoří rychlé charakterizace bioterapeutik.

Závěr

ACQUITY Premier UPLC se systémem BSM prokázal v peptide mappingu vynikající reprodukovatelnost retenčních časů a vylepšenou chromatografickou účinnost díky MaxPeak HPS technologii. Kombinace těchto vlastností vede k nižší pravděpodobnosti selhání analýz, snadnější validaci a přesnějšímu vyhodnocení atributů a nečistot biofarmaceutických molekul.

Reference

1. Kaffashan A, Wheat TE. ACQUITY UPLC System-to-System Reproducibility for Peptide Mapping. Waters Application Note, 2009.
2. Simeone J, Hong P, McConville PR. Performance of the ACQUITY UPLC I-Class PLUS System for Methods which Employ Long, Shallow Gradients. Waters Application Note, 2018.
3. Dao D, Koshel BM, Birdsall RE, Yu YQ. Peptide Mapping Retention Time Repeatability Under Shallow Gradient Conditions. Waters Application Note, 2020.
4. DeLano M et al. Using Hybrid Organic-Inorganic Surface Technology to Mitigate Analyte Interactions with Metal Surfaces in UHPLC. Analytical Chemistry. 2021;93:5773–5781.
5. Gilar M, DeLano M, Gritti F. Mitigation of Analyte Loss on Metal Surfaces in Liquid Chromatography. Journal of Chromatography A. 2021.
6. Birdsall RE et al. Reducing Metal-Ion Mediated Adsorption of Acidic Peptides in RPLC-Based Assays Using Hybrid Silica Chromatographic Surfaces. Journal of Chromatography B. 2021;122700.