Extraction of Catecholamines and Metanephrines from Human Plasma Biotage® Extrahera™ LV-200 and Low Volume SPE Prior to UHPLC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Správná extrakce katecholaminů a metanefrinů z lidského plazmatu je klíčová pro přesnou diagnostiku řady kardiovaskulárních a neuroendokrinních onemocnění. Minimalizace matrix efektů a dosažení nízkých mezí stanovitelnosti přímo ovlivňují klinickou spolehlivost výsledků a umožňují včasnou detekci patologických stavů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat automatizovaný postup extrakce šesti katecholaminů (norepinefrin, epinefrin, dopamin) a tří metanefrinů (normetanefrin, metanefrin, 3-methoxytyramin) z malého objemu plazmy pomocí SPE na platformě Biotage Extrahera LV-200 a porovnat jej s manuálním zpracováním na PRESSURE+ 96 systému. Následná analýza proběhla pomocí UHPLC-MS/MS za účelem zajištění vysoké citlivosti a přesnosti měření.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda použitá ve studii využívá slabě kationtově výměnnou SPE (EVOLUTE EXPRESS WCX 10 mg) pro selektivní izolaci analyzovaných látek. Klíčové kroky zahrnují:

• předúprava vzorku: přidání vnitřních standardů, pufrování a promíchání
• kondicionace a ekvilibraci sorbentu
• naložení vzorku, tři fáze mytí pro odstranění polárních, neutrálních a lipofilních interferentů
• eluce analyzátů, následná evaporace a rekonstituce v nízkém objemu

Platforma Biotage Extrahera LV-200 umožnila automatizaci všech kroků s celkovou dobou zpracování 96 vzorků cca 60 minut. Pro separaci a detekci sloužil UHPLC systém Shimadzu Nexera s kolonkou Avantor ACE Excel C18-PFP a tryskou AB SCIEX Triple Quad 5500 s pozitivní ESI.

Hlavní výsledky a diskuse

Obě srovnávané metody (automatická a manuální) prokázaly vysoké a reprodukovatelné výtěžky extrakce (65–83 % recovery) s relativními odchylkami pod 11 %. Kalibrační křivky vykázaly vynikající linearitu (r > 0,998) v rozsahu 10–500 pg/mL a limity stanovitelnosti byly v rozmezí 1–20 pg/mL v závislosti na analyzované látce. Matrix a signálové faktory byly nízké, což potvrzuje účinné odstranění interferencí. Automatizace výrazně snížila variabilitu mezi operátory a zkrátila pracovní zátěž laboratorního personálu.

Přínosy a praktické využití metody

Nově navržený postup nabízí následující výhody:

• vysoká reprodukovatelnost a nízké RSD
• nízké meze detekce vhodné pro klinickou diagnostiku
• zkrácení času a snížení chybovosti díky plně automatizovanému workflow
• kompatibilita s běžnými antikoagulanty (EDTA, heparin, citrát)

Metoda je vhodná pro rutinní laboratorní provoz, klinické studie a farmakokinetickou analýzu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření SPE automatizace na vyšší průtoky vzorků a integraci s on-line UHPLC systémy pro zkrácení doby analýzy. Dále lze uvažovat o multi-analyzátových panelech pro rozšířenou metabolomiku, využití ultra vysokotlakých kolon pro rychlejší separaci nebo zavedení isotopově označených standardů pro další zvýšení přesnosti.

Závěr

Automatizovaná extrakce na platformě Biotage Extrahera LV-200 spolu s optimalizovanou UHPLC-MS/MS metodikou poskytuje robustní, citlivé a vysoce reprodukovatelné stanovení katecholaminů a metanefrinů v lidské plazmě. Postup se osvědčil jak v klinické, tak ve výzkumné praxi a nabízí jednoduché a efektivní řešení pro laboratorní workflow.