Extraction of Three Phosphatidylethanol (PEth) Biomarkers in Human Whole Blood Using ISOLUTE® SLE+ Prior to LC/MS-MS Analysis

Význam tématu

Analýza fosfatidylethanolů (PEth) v lidské krvi je klíčová pro objektivní stanovení chronické konzumace alkoholu. PEth biomarkery odrážejí dlouhodobou spotřebu, neovlivňuje je akutní příjem a umožňuje spolehlivou forenzní a klinickou diagnostiku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout rychlou a účinnou metodu extrakce tří hlavních PEth izomerů (16:0, 16:0/18:1, 16:0/18:2) z plné krve pomocí ISOLUTE SLE+ destiček před následnou kvantifikací LC-MS/MS. Metoda měla zajistit vysoké výtěžky, nízké mezní hodnoty a čisté extrakty s minimální lipidovou interferencí.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek plné krve (200 µL) byl předúpravou smíchán s vnitřními standardy a zředěn vodou s acetonitrilem. Extrakce probíhala na ISOLUTE SLE+ destičkách, eluční roztok tvořil ethylester acetát:isopropanol (95:5) v třech krocích, následně se odpařovalo a reconstituci provádělo v isopropanolu.

Instrumentace:

• UHPLC Shimadzu Nexera X2 se sloupcem Agilent Poroshell 120 EC-C8 (2,1 × 50 mm, 2,7 µm)
• Mobilní fáze A: 5 mM mravenčan amonný ve vodě; B: isopropanol; gradient 40–0 % A (0–1 min), 0–100 % B (1–4 min)
• MS Shimadzu 8060 Triple Quadrupole, ESI; teplota rozhraní 400 °C, suchý plyn 5 mL/min, nebulizační plyn 3 L/min
• MRM tranzice pro cílové analyty s kolizními energiemi optimalizovanými pro každou lipidovou formu

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda poskytla extrakční výtěžky nad 60 % při RSD < 10 % pro všechny analyty. Detekční limity (LLOQ) dosáhly 0,5 ng/mL pro PEth 16:0 a 16:0/18:1 a 5 ng/mL pro PEth 16:0/18:2. Kalibrační křivky vykázaly linearitu r2 > 0,999 v rozsahu 0,5–5000 ng/mL. Podzařazené objemy vzorku přispěly k minimalizaci fosfolipidů v extraktu a stabilitě analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda kombinuje jednoduchou přípravu, minimalizaci emulzí a vysokou čistotu extraktů, což umožňuje rutinní screening i kvantitativní stanovení PEth biomarkerů v toxikologii, klinické diagnostice a QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření na automatizované platformy s vysokou průchodností, adaptace pro nové lipidové biomarkery a kombinace s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií pro komplexní lipidomické studie.

Závěr

Vyvinutá SLE+ LC-MS/MS metoda je robustní, citlivá a reprodukovatelná, nabízí rychlou analýzu PEth a úspěšně redukuje interferenci fosfolipidů, čímž podporuje spolehlivá klinická a forenzní vyšetření.