Extraction of Anabolic Steroids from Horse Urine Using ISOLUTE® SLE+ Prior to LC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Analýza anabolických steroidů v moči koní je klíčová pro kontrolu dopingu, zajištění integrity jezdeckých závodů a dodržování legislativních požadavků. Spolehlivá a reprodukovatelná metoda extrakce umožňuje odhalit zneužití látek, jako jsou ethylestrenol a stanozolol, chrání zdraví zvířat a podporuje spravedlivou soutěž.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem dokumentu je představit postup podpůrné kapalné extrakce (SLE) pomocí sorbentu ISOLUTE SLE+ pro izolaci ethylestrenolu a stanozololu z konské moči před následnou LC-MS/MS analýzou. Studie porovnává různé formáty (48-well, 96-well, kolony) a eluční rozpouštědla, hodnotí výtěžnost a opakovatelnost extrakce.

Použitá metodika a instrumentace

Postup extrakce:

• Předúprava: zředění vzorku moči vodou 1:1, promíchání.
• Naložení: do studeného ISOLUTE SLE+ 1 mL 48-well destičky se vkape 800 µL vzorku, nechá se absorbovat 5 minut.
• Eluce: trojnásobné použití 1 mL MTBE (případně DCM) gravitačně, dokončení průtoku tlakem 10–20 s.
• Post-eluce: odpaření při 40 °C pod proudem vzduchu nebo dusíku, rekonstituce 500 µL vody/ACN (20/80) s 0,1 % kyselinou mravenčí.

Použitá instrumentace:

• UPLC: Waters Acquity s kolonkou ACE Excel 2 C18 (50×2,1 mm), mobilní fáze A (2 mM amonný acetát, 0,1 % HCOOH ve vodě), B (2 mM amonný acetát, 0,1 % HCOOH v methanolu), průtok 0,4 mL/min, gradient dle tabulky.
• MS/MS: Premier XE triple kvadrupól s ESI v pozitivním módu, MRM přechody 329.0>94.8, 329.0>106.8 pro stanozolol; 271.1>120.8, 274.1>146.8 pro ethylestrenol.

Hlavní výsledky a diskuse

Testy na moči hřebce i kobylky (n=7) při koncentraci 40 ng/mL ukázaly vysoké výtěžnosti a dobrou opakovatelnost:

• 48-well destička (1 mL kapacita) s MTBE elucí: stanozolol >90 % (RSD <9 %), ethylestrenol >88 % (RSD <11 %).
• 400 µL destička: výtěžnost >85 % a >84 % (RSD <7 %, resp. <7 %).

Eluce DCM dosahovala podobných hodnot. Metoda nevytváří emulze a je vhodná pro různé formáty extrakce.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda SLE+ přináší:

• Vyšší výtěžnosti a reproducibilitu než klasické LLE.
• Eliminaci problémů s emulzemi.
• Flexibilitu formátů (96-well, kolony) pro vysokoprůtokové laboratoře.

Uplatnění v dopingové kontrole, farmaceutickém a veterinárním QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje:

• Automatizace a integrace s 96-well platformami pro vyšší propustnost.
• Rozšíření metodiky na širší spektrum steroidů a dalších bioaktivních látek.
• Kombinace s vysokorozlišovacími hmotnostními spektrometry pro screening neznámých metabolitů.
• Minimalizace objemů vzorku a rozpouštědel v duchu green chemistry.

Závěr

Popsaná podpora kapalné extrakce na ISOLUTE SLE+ nabízí robustní, rychlou a vysoce účinnou metodu pro izolaci ethylestrenolu a stanozololu z konské moči. Vysoké výtěžnosti, dobrá opakovatelnost a absence emulzí činí tuto metodu vhodnou pro rutinní dopingovou kontrolu a farmaceutickou analýzu.