A new IC-MS/MS approach for the analysis of bisphosphonates in horse plasma

Význam tématu

Bisfosfonáty představují skupinu silně polárních a chelatačních látek využívaných k léčbě kostních onemocnění u koní. Z důvodu možnosti zneužití při závodění jsou zařazeny mezi zakázané látky dle mezinárodní dohody IFHA, což vyžaduje spolehlivé, citlivé a selektivní analytické metody pro jejich detekci.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje novou bezderivatizační metodiku spojující iontovou chromatografii (IC) s trypletem kvadrupólového hmotnostního spektrometru (MS/MS) pro simultánní analýzu non-nitrogen a nitrogen-containing bisfosfonátů v koňské plazmě. Cílem bylo zkrátit vzorkovací práci, zvýšit selektivitu a citlivost a zjednodušit přípravu vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky koněcí plazmy (200 µL) byly obohaceny o interní standard, deproteinovány v kyselém prostředí a po přidání vody extrahovány SPE formou dvoustupňové extrakce na HLB a WAX sorbentech v 96-jamkových pla­tech. Extrakt byl rekonstituován do 100 µL vody a injektován (50 µL) na IC-MS/MS.

• Iontová chromatografie: Dionex ICS-6000 RFIC, kolona IonPac AS18-Fast (150×2 mm, 4 µm), KOH gradient 35–100 mM generovaný EG, průtok 0,25 mL/min, potlačená vodivost.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific TSQ Altis, H-ESI zdroj, režim SRM (selected reaction monitoring), make-up ACN 0,3 mL/min, Q1/Q3 rozlišení 0,7/1,2 FHMW.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda zajistila separaci všech sedmi bisfosfonátů do 14 minut. LOD v roztocích byl 50 fg/µL či nižší, linearita signálu byla pro koncentrace od 0,05 do 10 pg/µL. V koňské plazmě s přídavkem 5 ng/mL tiludronátu dosahoval S/N 150. Suppresovaná vodivost ukázala tzv. co-eluce tří sloučenin, ale extrakce jednotlivých SRM stop v MS/MS umožnila jednoznačnou identifikaci a kvantifikaci.

Přínosy a praktické využití metody

Nový přístup eliminuje časově náročnou derivatizaci, zjednodušuje přípravu vzorků a zvyšuje selektivitu díky kombinaci IC a MS/MS. Metoda je vhodná pro rutinní dopingovou kontrolu v koňských závodištích i pro laboratoře QA/QC v průmyslové analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

Popisovanou konfiguraci lze rozšířit na další velmi polární analyty, včetně kyselých metabolitů či farmaceutických látek. Dalšími směry jsou plná automatizace přípravy vzorků, využití vysokotlaké IC pro zrychlení separace a integrace do komplexních screeningových platforem.

Závěr

Vyvinutá IC-MS/MS metoda poskytuje citlivou, selektivní, rychlou a bezderivatizační analýzu bisfosfonátů v koni­ské plazmě. Je ideální pro rutinní a potvrzovací vyšetření při dopingové kontrole a má potenciál pro rozšíření na jiné vysoce polární látky.

Reference

1. International Federation of Horseracing Authorities. Article 6 of the International Agreement on Breeding, Racing and Wagering, 2018.
2. Zacharis C.K., Tzanavaras P.D. Determination of bisphosphonate active pharmaceutical ingredients in pharmaceuticals and biological material: a review of analytical methods. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2008, 48, 483–496.
3. Liu X.K., Fang J.B., Cauchon N., Zhou P. Direct stability-indicating method development and validation for analysis of etidronate disodium using a mixed-mode column and charged aerosol detection. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2008, 46, 639–644.
4. Zhu L.S., Lapko V.N., Lee J.W., Basir Y.J., Kafonek C., Olsen R., Briscoe C. A general approach for the quantitative analysis of bisphosphonates in human serum and urine by high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2006, 20, 3421–3426.
5. Popot M.A., Garcia P., Hubert C., Bolopion A., Bailly-Chouriberry L., Bonnaire Y., Thibaud D., Guyonnet J. HPLC/ESI-MSn method for non-amino bisphosphonates: application to the detection of tiludronate in equine plasma. Journal of Chromatography B 2014, 958, 108–116.