Trace Level Determination of Eleven Antiprotozoal Agents in Eggs after Simple Matrix Clean-Up

Význam tématu

Coccidiostáty jsou antiprotozoální přísady používané v krmivech drůbeže k prevenci kokcidiózy, choroby s významnými ekonomickými dopady na intenzivní chovy. Rezidua těchto látek mohou kontaminovat vejce a představovat riziko pro spotřebitele. Evropská legislativa stanovuje maximální limity reziduí (MRL) pro jedenáct schválených kokcidiostatik ve vejcích, přičemž kontrolní metody musí dosahovat stopových úrovní detekce.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a validovat automatizovanou on-line SPE–UHPLC–MS/MS metodu pro současné stanovení jedenácti kokcidiostatik ve vejcích na úrovních pod legislativními limity EU. Studie prezentuje optimalizaci materiálu pro SPE, chromatografickou separaci a hmotnostní spektrometrickou detekci, včetně přístrojové konfigurace založené na třech čerpadlech.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: homogenizovaný bílek a žloutek šesti vajec, extrakce kyselinou modifikovaným acetonitrilem, dosolení NaCl, odstředění a koncentrování.

On-line SPE a chromatografie:

• SolEx HRP SPE kartridž (2.1×20 mm)
• Acclaim PA2 kolona (2.1×150 mm, 3 μm)
• Dual Gradient Pump (DGP-3600BM / HPG-3200SD)
• Autosampler WPS-3000SL, termostat TCC-3000SD
• Dionex Valve Pod a Valve Actuator Kit
• Viper SST a nanoViper kapiláry, T-piece pro on-line ředění
• TurboFlow Cyclone-P cartridge (50×0.5 mm) pro srovnání
• Triple quadrupole LC-MS/MS s ESI+, ESI– a SRM režimem

Metoda využívá dvě sekvenční injekce: metoda 1 pro polaritu clopidol, diclazuril, halofuginon, nicarbazin a robenidin s mobilní fází 15–70 % MeOH; metoda 2 pro nepolární ionofory decoquinate, lasalocid, maduramicin, monensin, narasin, salinomycin s gradientem 45–100 % MeOH. On-line ředění a refokusace zabezpečují dostatečné zachycení i eluci látek v širokém rozmezí polarity.

Hlavní výsledky a diskuse

Srovnání SPE materiálů ukázalo vyvážené retenční vlastnosti SolEx HRP oproti Cyclone-P. On-line SPE vedlo k více než čtyřnásobnému snížení šumu signálu proti off-line SPE a k dosažení nižších LOD (0.02–0.5 μg/kg) a LOQ (0.06–1.5 μg/kg). Lineární kalibrace vykazovala koeficienty r = 0.9879–0.9993. Obnovy v matici spíše překračovaly 90 % (90–118 %) s rozšířenou nejistotou do 37 %, splňující požadavky EU.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda zkracuje celkový čas přípravy vzorku na polovinu, minimalizuje pracovní zásah, snižuje expozici nebezpečným chemikáliím a zvyšuje opakovatelnost výsledků. Díky vysoké citlivosti a spolehlivosti je vhodná pro rutinní screening a kvantifikaci reziduí kokcidiostatik ve vejcích v rámci oficiální kontroly potravin.

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizace a miniaturizace on-line SPE systémů,
rozšíření metody na další skupiny veterinárních léčiv,
integrace s vysokým rozlišením MS,
využití nových sorbentů s vyšší selektivitou a kapacitou,
aplikace v jiných typu potravinářských matricích.

Závěr

Vyvinutá on-line SPE–UHPLC–MS/MS metoda pro jedenáct kokcidiostatik ve vejcích prokázala vysokou citlivost, přesnost i robustnost. Dvě sekvenční chromatografické cesty zvládají široké spektrum polarity látek, přičemž validace potvrdila shodu s legislativními požadavky EU. Metoda je ideální pro rutinní kontrolu reziduí ve vejcích.

Reference

• Regulation (EC) No 1831/2003 of the European Parliament and of the Council on additives for use in animal nutrition.
• Directive 70/524/EEC on additives in animal nutrition.
• Commission Regulation (EU) No 37/2010 on pharmacologically active substances and MRLs in foodstuffs of animal origin.
• Commission Regulation (EC) No 124/2009 setting maximum levels for coccidiostat residues in food.
• Mortier L., Daeseleire E., Delahaut P. Simultaneous detection of five coccidiostats in eggs by LC-MS/MS. Anal. Chim. Acta 2003, 483, 27–37.
• Vincent U., Chedin M., Yasar S., von Holst C. Determination of ionophore coccidiostats in feeding-stuffs by LC-MS/MS. J. Pharm. Biomed. Anal. 2008, 47, 750–757.
• Dubois M., Pierret G., Delahaut P. Efficient detection of nine coccidiostats in egg and muscle by LC-ESI-MS/MS. J. Chromatogr. B 2004, 813, 181–189.
• Delahaut P., Pierre G., Ralet N., Dubois M., Gillard N. Multi-residue method for coccidiostat carry-over in feed by HPLC-MS/MS. Food Addit. Contam. 2010, 27(6), 801–809.
• Commission Decision 2002/657/EC implementing Council Directive 96/23/EC on analytical method performance.
• Council Regulation (EEC) No 2377/90 laying down MRLs of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin.
• SLMB. Kokzidiostatika in Geflügelfleisch und Eiern; LC-MS/MS, SLMB 1571.2, 2008.