Analysis of protein drugs aggregation Using Size Exclusion Chromatography

Význam tématu

Monoklonální protilátky a antibody drug conjugates jsou klíčové biologické léčivé přípravky, jejichž agregace negativně ovlivňuje účinnost a bezpečnost. Pevná kontrola agregace je nezbytná v průmyslové výrobě i kontrolních laboratořích. Metoda size exclusion chromatography umožňuje spolehlivou detekci a kvantifikaci agregátů díky rozdílům v hydrodynamickém poloměru molekul. Potlačení sekundárních interakcí zvyšuje kvalitu separace a opakovatelnost výsledků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo optimalizovat separaci monomerů, agregátů a fragmentů terapeutických proteinů (mAb, ADC) pomocí UHPLC systému Nexera XS inert a SEC kolony Shim-pack Bio Diol. Zaměřili jsme se na potlačení elektrostatických a hydrofobních interakcí přidáním solí a organických rozpouštědel do mobilní fáze.

Použitá metodika

Vzorky: mAb a ADC 1 mg/mL v deionizované vodě. Mobilní fáze pro mAb: 100 mmol/L fosfátový pufr pH 6,9 s/bez 150 mmol/L NaCl. Mobilní fáze pro ADC: 100 mmol/L fosfátový pufr pH 6,9 s obsahem acetonitrilu 0–15 %. Parametry: průtok 0,2 mL/min, teplota kolony 25 °C, injekční objem 5 µL, detekce při 280 nm.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Nexera XS inert
• SEC kolona Shim-pack Bio Diol-300 (150 × 4,6 mm I.D., 2 µm)
• UV detektor SPD-M40 (280 nm)
• TORAST-H skleněné vialy

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza mAb ukázala, že bez NaCl dochází k zašpičatění monomeru. Přidání 150 mmol/L NaCl potlačilo elektrostatické interakce a zlepšilo tvar špičky, čímž se zvýšila separace agregátů a fragmentů.
Analýza ADC poukázala na silné zašpičatění monomeru bez acetonitrilu. Zvýšení koncentrace acetonitrilu až na 15 % potlačilo hydrofobní interakce a zlepšilo tvar špičky, přičemž vyšší koncentrace organického rozpouštědla mohou vést k riziku denaturace proteinu.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaná SEC s inertním UHPLC systémem umožňuje spolehlivou kvantifikaci agregátů i při použití vysoké koncentrace solí či organických modifikátorů. Metoda je vhodná pro QA/QC laboratoře v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu pro validaci stability a kontinuální monitorování výroby.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další miniaturizace a integrace SEC s hmotnostní spektrometrií, vývoj nových inertních materiálů pro kolony, adaptace na vyšší průtoky a teplotní kontroly a aplikace pokročilých monolitických materiálů mohou zvýšit citlivost a rychlost analýzy.

Závěr

Užití UHPLC systému Nexera XS inert s vhodnými aditivy v mobilní fázi prokazatelně zlepšilo separaci agregátů terapeutických proteinů. Metoda přispívá k vyšší reprodukovatelnosti dat a bezpečnosti léčivých přípravků.

Reference

1. Rosenberg AS. Effects of protein aggregates: an immunologic perspective. AAPS J. 2006;8:E501–E507.
2. Striegel AM, Yau WW, Kirkland JJ, Bly DD. Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography. 2nd ed. John Wiley & Sons; 2009.
3. Arakawa T, Ejima D, Tsumoto K, Gagnon P. Solvent modulation of chromatography. J Biochem Soc Jpn. 2008;80(1):45–51.