Understanding the effects of column temperature on high resolution glycan separations

VÝZNAM TÉMATU

Rozbor glykanů u terapeutických monoklonálních protilátek je klíčový, protože N-glykosylace ovlivňuje biologickou aktivitu, polaritu, afinitu k receptorům a imunitní odpověď. Spolehlivé oddělení variant glykanů a jejich kvantifikace jsou nezbytné pro kompatibilitu šarží léčiv a dodržení regulačních nároků.

Cíle a přehled studie

Studie porovnává schopnost kolony Thermo Scientific Accucore 150 Amide HILIC (2.6 μm, solid core) s konkurentní plně porézní 1.7 μm HILIC kolonou při separaci 2-AB značených N-glykanů z monoklonálních protilátek. Hlavním cílem bylo zjistit vliv teploty kolony na rozlišení glykanů a ověřit reprodukovatelnost a selektivitu separací.

Použitá metodika a instrumentace

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Thermo Scientific Vanquish Flex (Binary pump H, Split sampler HT, Column compartment H, Fluorescence detector F)
• Mass spektrometr Thermo Scientific Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap
• Magnetický stojan Invitrogen DynaMag-2
• Termální blok Fisher Isotemp

Reagencie a spotřební materiál

• GlycanAssure HyPerformance APTS Kit
• Ammonium formate, acetonitril, formic acid (UHPLC-MS grade)
• DMSO, 2-AB, acetic acid, triethylamine, PNGase F
• Magnetické kuličky pro čištění

Hlavní výsledky a diskuse

• Nižší teplota kolony (35–45 °C) zlepšila rozlišení izomerů FA2(6)G1 a FA2(3)G1 s R~1.92 vs. ~1.82 při 60 °C.
• Accucore 150 Amide HILIC prokázala lepší separaci minoritních glykanů (např. FA2B(3)G1) a hybridních forem (hybMan5N) než konkurenční kolona.
• Unikátní oddělení klíčových párů glykanů, jako hybMan5FN vs. FA2(6)G1aGal a hybMan4(6)G1S1 vs. FA2G2, nebylo dosaženo na konkurenci.
• Masově spektrometrická identifikace s přesností ±0.5 ppm potvrdila struktury doprovázené retencí.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší rozlišení glykanů umožňuje přesnější kvantifikaci izomerů, včetně potenciálně imunogenních struktur.
• Nižší provozní teplota prodlužuje životnost kolony a snižuje tlak v systému.
• Metoda zvyšuje datovou kvalitu a spolehlivost QC analýz bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Zaměření na vývoj pokročilých stacionárních fází s optimalizovanou interakcí pro polaritu glykanů, integrace s multimodálními detektory a automatizace workflow. Další rozvoj kvantitativních standardů a štítkovacích technik má potenciál zvýšit citlivost a robustnost glykanové analýzy.

Závěr

Accucore 150 Amide HILIC kolona v kombinaci s UHPLC-MS detekcí poskytuje vysoké rozlišení, reprodukovatelnost a selektivitu při analýze 2-AB značených N-glykanů z terapeutických protilátek. Nižší pracovní teplota kolony výrazně zlepšuje separace klíčových struktur bez zásadní ztráty průchodnosti.

Reference

1. Reider B. et al. Evaporative fluorophore labeling of carbohydrates via reductive amination. Talanta 2018, 185, 365–369.
2. Szabo Z. et al. A Streamlined Workflow for Twoplexing of N-linked Glycans Using Light (12C6) and Heavy (13C6) Isotopologues. Anal. Chim. Acta 2020, 1099, 155–164.
3. Hilliard M. et al. Glycan characterization of the NIST RM monoclonal antibody. MAbs 2017, 9(8), 1349–1359.