LC-MS Analysis of Highly Sialylated Glycans Using MS Compatible Mixed Mode Chromatographic Separation

Význam tématu

Analýza vysoce sialylovaných N-glykanů je klíčová pro charakterizaci glykovaných bioterapeutik, protože určuje jejich clearance, stabilitu a biologickou aktivitu.
Konvenční HILIC/FLR/MS metody často postrádají dostatečnou rozlišovací schopnost pro isomerické a vysoce nabité glykany.

Cíle a přehled studie

Studie představuje vývoj a validaci LC-FLR-MS metodiky využívající MS-kompatibilní mixed mode chromatografii (RP/AX) pro analýzu vysoce sialylovaných glykanů u rekombinantního erytropoetinu (rEPO). Cílem je porovnat výkonnost mixed mode separace s klasickou HILIC technikou a demonstrovat výhody v oblasti rozlišení a citlivosti.

Použitá metodika a instrumentace

Pro uvolnění a označení glykanů byl použit kit GlycoWorks RFMS. Separace probíhala na BioAccord systému spojeném s ACQUITY Premier LC, FLR detektorem a Q-TOF MS.

• Sloučenina vzorku: rekombinantní erytropoetin (EPO) z European Pharmacopeia a StemCell Inc.
• Příprava: buffer exchange na vodu Milli-Q, značení RFMS, injekční objem 1 µl.
• Sloupce: mixed mode ACQUITY Premier Glycan BEH C18 AX (2,1×150 mm, 1,7 µm); komparačně HILIC ACQUITY Premier Glycan Amide (2,1×150 mm, 1,7 µm).
• Mobilní fáze: pro mixed mode 100 mM NH4HCO2 / 100 mM kyselina mravenčí ve vodě/acetonitrilu 40/60; pro HILIC voda / 50 mM NH4HCO2 / acetonitril.
• Podmínky: teplota kolony 60 °C, teplota vzorku 6 °C, FLR detekce (EX=265 nm, EM=425 nm), MS rozhraní s MaxEnt 3 dekonvolucí.

Hlavní výsledky a diskuse

Mixed mode RP/AX separace přinesla výrazné zkrácení šířky píků (cca 20 %) u izomerických sialylovaných glykanů ve srovnání s HILIC. Oddělení probíhá kombinací hydrofobních a iontově-výměnných interakcí, čímž se rozlišují glykany podle počtu sialových zbytků a celkového náboje.
Charge-driven separace umožnila skupinové eluce podle náboje (neutralní, +1S, +2S, +3S, +4S), což usnadnilo identifikaci komplexních struktur, jako jsou fucosylované tetraantennární glykany FA4S3.
Vysokoenergetická fragmentace dodala podrobná data o sekvenci monosacharidů a lokalizaci substitucí.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vyšší rozlišovací schopnost pro vysoce sialylované glykanové formy, zkrácenou dobu analýzy a zvýšenou citlivost detekce.
Umožňuje spolehlivou kvantifikaci a strukturální charakterizaci glykanů v bioterapeutických výrobcích pro QA/QC a výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

Implementace mixed mode separace může být rozšířena na analýzu O-glykanů a glykoproteomiku.
Integrace s automatizovanými platformami umožní vysokopropustné glykanové profilování.
Další vývoj MS detekce přinese cílené metody pro zlepšení analýzy nízkootáčkových a polymodifikovaných látek.

Závěr

Optimalizovaná LC-FLR-MS metoda s mixed mode RP/AX kolony na BioAccord systému významně zlepšuje rozlišení a identifikaci vysoce sialylovaných N-glykanů u rEPO ve srovnání s tradiční HILIC technikou a poskytuje robustní nástroj pro analytickou kontrolu glykovaných bioterapeutik.