Improving Released N-glycan Analysis in Biotherapeutic Development Using the ACQUITY Premier Solution with MaxPeak High Performance Surfaces (HPS) Technology

Význam tématu

Glykozylace bioterapeutik ovlivňuje bezpečnost, účinnost a stabilitu léčivých proteinů a je považována za klíčovou kvalitativní vlastnost během vývoje a výroby.

Přesná analýza uvolněných N-vázaných glykanů umožňuje monitorovat variace výrobního procesu, zajistit konzistenci produktu a předcházet nežádoucím imunogenním nebo farmakokinetickým změnám.

Cíle a přehled studie

Tato studie si klade za cíl porovnat výtěžnost a kvalitu analýzy kyselých glykanů (sialylovaných a fosforylovaných) pomocí standardní platformy BioAccord a nového řešení ACQUITY Premier s MaxPeak High Performance Surfaces (HPS) technologií. Dále demonstruje přenositelnost metodiky a použitelnost stávající GU knihovny v UNIFI na nové instrumentální konfiguraci.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza uvolněných glykanů byla provedena pomocí HILIC-ACQUITY FLR/MS s fluorescentním značením RapiFluor-MS. Porovnání proběhlo mezi:

• BioAccord LC-MS System s ACQUITY UPLC BEH Amide column
• BioAccord System s ACQUITY Premier LC a Glycan BEH Amide column s MaxPeak HPS

MS detekce byla zajištěna pomocí ACQUITY RDa time-of-flight detektoru v ESI + režimu (50–2000 m/z). Data byla zpracována ve waters_connect s UNIFI workflow „Glycan FLR with MS confirmation“.

Hlavní výsledky a diskuse

Srovnání relativní výtěžnosti sialylovaných glykanů ukázalo nárůst průměrné abundance z 2,11 % na 2,22 % při použití Premier konfigurace, zatímco neutrální glykan FA2 zůstal na 20,5 %. Signálové odezvy čtyř reprezentativních sialylovaných glykanů byly u Premier řešení konzistentně vyšší.

U fosforylovaných glykanů (mannose-6-phosphate) došlo při použití Premier technologie ke třikrát vyšší detekční citlivosti a významně plynulejšímu tvaru špiček. Reprodukovatelnost měření (RSD) pro M6P činila 3,96 % při 15 opakováních.

GU hodnoty glykanů stanovené z kalibrovaných retenčních časů byly konzistentní mezi oběma systémy (SD 0,001 GU), čímž je potvrzena jednoduchá přenositelnost metodiky a knihovny.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace ACQUITY Premier s MaxPeak HPS významně zvyšuje spolehlivost a komplexnost glykanové analýzy v bioprocesním vývoji a kvalitativní kontrole. Metoda zlepšuje výtěžnost a tvar špiček kyselých glykanů, minimalizuje systematické ztráty a umožňuje přesnější kvantifikaci klíčových glykoform.

Budoucí trendy a možnosti využití

MaxPeak HPS technologie otevírá cestu k analýze dalších kovově citlivých biomolekul, jako jsou fosfolipidy nebo metabolity s karboxylátovými skupinami. Rozvoj rozsáhlejších GU knihoven a pokročilých datových platforem podpoří automatizaci i v GMP prostředí.

Závěr

ACQUITY Premier řešení s MaxPeak HPS účinně odstraňuje nežádoucí interakce kovových povrchů s kyselými glykanovými strukturami, což vede k vyšší výtěžnosti, lepší tvaru chromatografických špiček a konzistentním GU hodnotám. Metodika je plně kompatibilní s existujícími UNIFI knihovnami a umožňuje robustní a reprodukovatelnou kontrolu glykozylace bioterapeutik.

Reference

1. Higel F, et al. N-glycans of Complex Glycosylated Biopharmaceuticals and their Impact on Protein Clearance. Eur J Pharm Biopharm. 2019;139:123–131.
2. Zhang P, et al. Challenges of Glycosylation Analysis and Control: An Integrated Approach to Producing Optimal and Consistent Therapeutic Drugs. Drug Discov Today. 2016;21(5):740–765.
3. Yu Y. Applying a Novel Glycan Tagging Reagent, RapiFluor-MS, and An Integrated UPLC-FLR/QTof MS System for Low Abundant N-Glycan Analysis. Waters Appl Note. 2015;720005383EN.
4. Zhang X, et al. Increasing Productivity and Confidence for N-linked Glycan Analysis of Biosimilars Using the BioAccord System. Waters Appl Note. 2019;720006545EN.
5. Isaac G, Plumb R. ACQUITY Premier LC Technology Improves Sensitivity for Phosphorylated and Carboxylate Lipids. Waters Appl Note. 2021;720007092EN.
6. Tanna N, Plumb R. Advantages of ACQUITY Premier System and Columns with MaxPeak HPS for Bioanalysis of Gefitinib. Waters Appl Note. 2021;720007122EN.
7. Liu X, Lauber M. High Performance Surface Technology Improves HILIC Profiling of Released N-Glycans. Waters Appl Note. 2021.
8. Kang JF, et al. Lysosomal Targeting Enhancement by Conjugation of Glycopeptides Containing Mannose-6-phosphate. Sci Rep. 2018;8:8730.
9. Yu Y. N-linked Glycan Characterization and Profiling: Combining Accurate Mass, GU, and UNIFI Software. Waters Appl Note. 2016;720004845EN.