Monoclonal antibody mass confirmation using intact protein deconvolution for a compliance-ready manufacturing environment

Význam tématu

Analýza intaktních proteinů metodou hmotnostní spektrometrie je klíčová v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu pro rychlé potvrzení molekulární hmotnosti terapeutických protilátek bez potřeby složité přípravy vzorku. Rozlišení mezi denaturačními a nativními podmínkami umožňuje identifikovat různé proteoformy a glykovarianty v jediném měření. Pro provozní laboratoře s požadavky na validaci a dodržování předpisů je nezbytné mít robustní a plně sledovatelné pracovní postupy zahrnující jak sběr dat, tak zpracování a reporting.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje implementaci kompletního workflow od vzorku po výsledek za pomoci orbitrapového hmotnostního spektrometru Thermo Scientific™ Orbitrap Exploris™ 240 a softwaru Thermo Scientific™ Chromeleon™ CDS s volbou Intact Protein Deconvolution (IPD). Cílem bylo:

• Ověřit citlivost, přesnost a reprodukovatelnost měření intaktní hmotnosti standardní monoklonální protilátky (NISTmAb).
• Prokázat možnost automatizované analýzy velkých sérií (50 po sobě jdoucích injekcí) pod dohledem Chromeleon CDS.
• Ukázat bezproblémové přenesení metodiky z BioPharma Finder™ 4.0 do Chromeleon CDS pomocí Intact Protein Workbook.

Použitá metodika

Vzorek: NISTmAb 1 μL (1 μg/μL) ve vodě s 0,1 % kyselinou mravenčí.
Chromatografie: Vanquish Horizon UHPLC; kolona MAbPac RP 2,1 × 50 mm, 4 μm; eluce 8min. gradientem 25–80 % acetonitrilu (0,1 % HCOOH); tok 0,25 mL/min.
Hmotnostní spektrometrie: Orbitrap Exploris 240 vybaven BioPharma Option; režim Full MS, m/z 2000–5000, rozlišení 30 000 (FWHM), AGC 3E6, max. injekční čas 200 ms, source fragmentace 110 V.
Zpracování dat: BioPharma Finder 4.0 pro generování Intact Protein Workbook (ReSpect pro nativní, Xtract pro isotopicky rozlišené vzorky) a Chromeleon CDS 7.2.10 s IPD. Cílená dekonvoluce s tolerancí 10 ppm bez nutnosti ručních úprav parametrů.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC system (Flex/Horizon, Binary Pump, Split Sampler HT, Column Compartment, MS Connection Kit)
• Thermo Scientific MAbPac RP 2,1 × 50 mm, 4 μm
• Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240 s BioPharma Option
• Software: Chromeleon 7.2.10 CDS s Intact Protein Deconvolution; BioPharma Finder 4.0

Hlavní výsledky a diskuse

Po 50 za sebou jdoucích injekcích byl zaznamenán RSD retence 0,61 % a konzistentní tvar i počet nábojových obálek (m/z 2200–4000). Dekonvoluce pomocí cíleného seznamu pěti nejhojnějších glykovariant (A2G0F/A2G1F, A2G0F/A2G2F, 2×A2G0F, A2G1F/A2G2F, 2×A2G2F) proběhla automaticky se stoprocentním úspěchem v toleranci 10 ppm. Vizualizace byla realiseována přímo v Chromeleon CDS včetně XIC a výstupního reportu bez nutnosti dalších zásahů.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a validovatelná metoda pro potvrzení hmotnosti mAb v QA/QC laboratořích.
• Jednoduché přenesení parametrů z vývojového softwaru BioPharma Finder do produkčního Chromeleon CDS.
• Automatizace zpracování velkých sérií vzorků s reportingem splňujícím regulace.
• Vysoká citlivost, přesnost a reprodukovatelnost šetří čas a redukuje chyby.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření nativní MS pro komplexní charakterizaci mAb včetně komplexů a interakcí. Integrace strojového učení pro predikci proteoformního spektra a online monitoring procesů výroby biologik. Další automatizace a propojení s LIMS zajistí snadnější dodržování předpisů a vyšší throughput.

Závěr

Komplexní workflow s Orbitrap Exploris 240 a Chromeleon CDS umožňuje efektivní, reprodukovatelnou a compliant analýzu intaktních bílkovin. Cílená dekonvoluce na základě BioPharma Finder Workbooku přináší jednoduché nasazení v prostředí QA/QC bez nutnosti manuálních úprav metod.

Reference

1. Scheffler K. & Damoc E. Full characterization of heterogeneous antibody samples under denaturing and native conditions on the Q Exactive BioPharma mass spectrometer. Thermo Scientific Application Note 72348 (2017).
2. Füssl F. et al. Comprehensive characterisation of the heterogeneity of adalimumab via charge variant analysis hyphenated on-line to native high resolution Orbitrap mass spectrometry. MAbs 2018. doi:10.1080/19420862.2018.1531664.
3. Füssl F. et al. Cracking proteoform complexity of ovalbumin with anion-exchange chromatography–high-resolution mass spectrometry under native conditions. Journal of Proteome Research 2019. DOI:10.1021/acs.jproteome.9b00375.
4. Kristensen D.B. et al. Increasing throughput of native SEC-MS in biopharmaceutical development using a tandem UHPLC setup. Thermo Scientific Customer Application Note 73423 (2020).
5. Carillo S. & Bones J. Sensitive profiling of IgG1 monoclonal antibody variants under native conditions. Thermo Scientific Application Brief 73554 (2020).