Determination and quantitation of catecholamines and metanephrines in urine with an efficient sample preparation and LC-MS/MS workflow for clinical research use

Význam tématu

Quantifikace katecholaminů (dopamin, epinefrin, norepinefrin) a jejich metabolitů metanefrinů v moči je zásadní pro biochemický screening neuroendokrinních onemocnění, jako jsou feochromocytomy a paragangliomy. Spolehlivá a citlivá analýza těchto molekul umožňuje včasnou diagnostiku, sledování terapie a posouzení rizika recidivy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout jednoduchou, rychlou a ekonomickou metodu pro stanovení katecholaminů a metanefrinů v moči bez použití pevné fáze extrakce (SPE). Pracovní postup kombinuje kapalně-kapalnou extrakci (LLE) s vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií a detekcí pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS) na systému Thermo Scientific UltiMate 3000 RS spojeném s TSQ Endura.

Použitá metodika a příprava vzorku

Vzorek moči se centrifugoval a do 1 mL supernatantu se přidalo 50 µL roztoku stabilizovaných izotopově značených interních standardů a 1600 µL roztoku 2-aminoetyl-difenylboronátu (2 g/L). pH se upravilo na 9,5 octovou kyselinou a směs se extrahovala 1,5 mL ethylacetátu po 60 s vortexování. Po odstředění se 800 µL organické fáze odpařilo pod dusíkem a zbytek se rekonstituoval v 200 µL mobilní fáze A.

Použitá instrumentace

• Kapalinová chromatografie: Thermo Scientific UltiMate 3000 RS Binary Gradient LC
• Kolona: Acclaim Mixed-Mode WCX-1, 2,1 × 150 mm, 3 µm, 40 °C
• Mobilní fáze: A – 2 mM amonný formiát/0,1 % kyselina mravenčí; B – acetonitril/0,1 % kyselina mravenčí; gradient 10 min
• Hmotnostní spektrometrie: TSQ Endura s HESI v pozit. módu, SRM se dvěma přechody na analyzát pro kvantifikaci a potvrzení

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda vykázala lineární rozsah 0,4–900 ng/mL (R² > 0,998) pro všechny analyty a dolní kvantifikační mez (LLOQ) 0,4 ng/mL. Intra‐assay i inter‐assay přesnost (RSD) byla v rozmezí 2–15 % a bodová odchylka zpětně vypočtených koncentrací od nominálních hodnot nepřekročila 20 %. Matricový efekt se pohyboval v rozmezí cca 85–205 %, což potvrzuje vhodnost interních standardů pro korekci vlivu složení matrice.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace SPE snižuje čas a náklady na přípravu vzorku.
• Robustní chromatografie na smíšené módní koloně zajišťuje reprodukovatelné oddělení blízce příbuzných sloučenin.
• Vysoce selektivní SRM detekce na triple kvartupólu přináší vynikající citlivost a spolehlivost kvantifikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření nasazení LC-MS/MS metod s minimální předúpravou pro masové skríningové programy a personalizovanou medicínu. Dalším trendem je automatizace LLE a integrace s online systémem pro rychlou analýzu většího počtu vzorků. Kombinace s vyspělými datovými nástroji a strojovým učením může zvýšit diagnostickou hodnotu kvantitativních dat.

Závěr

Popsaná LLE-LC-MS/MS metoda umožňuje rychlou, přesnou a ekonomickou analýzu katecholaminů a metanefrinů v moči. Jednoduchá příprava vzorku bez SPE, kvalitní chromatografické oddělení a spolehlivá detekce na TSQ Endura splňují nároky výzkumných i klinických laboratoří na vysokou citlivost a reprodukovatelnost.

Reference

• Kushnir MM, Urry FM, Frank EL, Roberts WL, Shushan B. Clin Chem. 2002;48:323.
• Taylor RL, Singh RJ. Clin Chem. 2002;48:533.
• Petteys BJ, Graham KS, Parnas ML, Holt C, Frank EL. Clin Chem Acta. 2012;413:1459.
• Talwar D et al. J Chromatogr B. 2002;769:341–349.