LC-MS: Ultra-robust micro-flow LC-MS/MS for targeted high-throughput peptide quantification using the Vanquish Neo UHPLC system

Význam tématu

Micro-flow LC-MS/MS kombinuje vysokou citlivost detekce proteomů s propustností potřebnou pro velké kohorty vzorků. Zatímco nano-flow systémy nabízejí vynikající hloubku analýzy, jejich dlouhé doby cyklů a nižší robustnost omezují použití v rutinním testování. Moderní UHPLC systémy s mikro-flowmi a výkonnými hmotnostními spektrometry umožňují rychlou a opakovatelnou kvantifikaci peptidů, což je klíčové pro validaci biomarkerů a aplikace QA/QC v biotechnologii, farmacii a klinické proteomice.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo adaptovat a otestovat publikovanou metodiku vysokopropustné mikro-flow LC-MS/MS na novém systému Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC. Autoři hodnotili robustnost, opakovatelnost a výkon metody při dlouhodobém provozu (>760 injekcí) s cyklem menším než 15 minut, což umožňuje provést až 100 analýz za den.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Vanquish Neo s Binary Pump N, Split Sampler NT, termostatovaným sloupcem
• Kolona: Acclaim PepMap 1,0 mm × 15 cm, 50 μm nanoViper kapiláry
• MS detekce: TSQ Altis triple quadrupol v režimu SRM
• Zdroj: OptaMax NG HESI s maloprůtokovou jehlou
• Softwarové řízení: Chromeleon 7.2.10 MUd nebo Xcalibur 1.5.1

Metodika

Vzorky obsahovaly HeLa proteinový digest s 25 fmol standardních PRTC peptidů na injekci. Objem vzorku byl 1 μL. Metoda zahrnuje:

• Přímou injekci a rychlé nabíjení smyčky při 100 μL/min
• Gradient separaci 1 → 35 % organické fáze B při 50 μL/min
• Celkový cyklus 14,4 min (10,7 min gradient, zbývající čas zahrnuje praní a ekvilibraci)
• SRM akvizici s 12 kvantifikovatelnými peptidy, cyklus 0,5 s

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda vykázala:

• Stabilní tlakové profily s variací <3 bar během 760 injekcí
• Extrémně konzistentní retence peptidů (RSD <0,5 %, většinou <0,1 %)
• Reprodukovatelné plochy chromatografických píků (RSD <10 % pro 10 z 12 peptidů, dvě s RSD do 15 %)
• Propustnost až 100 vzorků za 24 hodin bez pozorovaných poklesů výkonu LC ani MS

Přínosy a praktické využití metody

Tato mikro-flow LC-MS/MS metodika přináší rychlou, vysoce opakovatelnou kvantifikaci peptidů s nízkými provozními nároky. Je ideální pro validaci větších souborů vzorků v translační proteomice, farmaceutickém vývoji a QA/QC, kde je klíčová jak citlivost, tak throughput.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zkracování doby analýzy, automatizace přípravy vzorků a integrace s datově nezávislými akvizicemi (DIA). Rozšíření aplikací na klinické a regulačně náročné studie by mohlo vést k zavedení mikro-flow LC-MS v diagnostických laboratořích a při rutinním sledování proteinových biomarkerů.

Závěr

Adaptovaná mikro-flow LC-MS/MS metoda na systému Vanquish Neo UHPLC demonstrovala vynikající robustnost, stabilitu a throughput při dlouhodobém provozu. Díky krátkým cyklům a reprodukovatelné kvantifikaci peptidů je vhodná pro velké kohorty vzorků a průmyslové aplikace.

Reference

• Boychenko A. et al., Technical Note 73208, Thermo Scientific 2019
• Meding S., Boychenko A., Chromatography Today 2016, 3, 43–45
• Bian Y. et al., Nat. Commun. 2020, 11, 157
• Bian Y., Bayer F.P. et al., Anal. Chem. 2021, 93(8), 3686–3690
• EMA Guideline on bioanalytical method validation, 2011