Quantitative targeted nano- and capillary- flow LC-MS peptide analysis using the Vanquish Neo UHPLC System coupled to a triple quadrupole mass spectrometer

Význam tématu

Analytika peptidů pomocí kapalinové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) je klíčová v proteomice, klinickém výzkumu i farmaceutické kontrole kvality. Nízkoprůtokové separační režimy (nano- a kapilární-flow) přinášejí vyšší citlivost detekce díky lepší ionizaci a ostřejším chromatografickým píkům. Současně ale vyžadují robustní instrumentaci a optimalizované metody pro rychlou a opakovatelnou analýzu velkých sérií vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat kvantitativní výkon cílené analýzy peptidů při nano- a kapilárním průtoku na jednom hardware platformě (Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC + TSQ Altis QqQ MS). Modelovým systémem byl HeLa proteinový digest s přidanou směsí izotopově značených PRTC peptidů v rozsahu 0,01–100 fmol/µL. Hodnoceny byly linearita, limity kvantifikace (LoQ), rozlišení, precizita, robustnost a celková doba analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku:

• HeLa Digest/PRTC standard rekonstituován v 0,1 % kyselině mravenčí, sonikace a opakované aspirace.
• Série dilucí PRTC ve 166 ng/µL matrice HeLa pro koncentrace 0,01–100 fmol/µL.

Chromatografie a MS:

• UHPLC: Vanquish Neo UHPLC v režimu přímé nano/capilární injekce.
• Kolony: PepMap Neo C18 15 cm; nano-flow 75 µm ID, kapilární-flow 150 µm ID; 2 µm částice.
• Režimy: nano-flow 0,3 µL/min (27min gradient), kapilární-flow 3,0 µL/min (12,4min gradient).
• MS detekce: Thermo TSQ Altis QqQ, ESI, SRM 600 přechodů/s, cyklus 0,5–0,8 s, kladná ionizace.

Hlavní výsledky a diskuse

• Průtokový přechod na kapilární-flow snížil dobu analýzy o 60 % (10 běhů z 504 na 203 minut) díky vyšší rychlosti gradientu, kratší reekvilibraci a načítání vzorku.
• Kapilární-flow zachoval vynikající linearitu (r > 0,999) i limity kvantifikace (100–10 000 amol/µL) pro 15 PRTC peptidů, srovnatelné s nano-flow.
• Chromatografické píky byly u kapilární-flow ostřejší (o 75–80 % nižší šířka na poloviční výšku), což zlepšuje S/N poměr a selektivitu.
• Robustnost: po 200 injekcích během 75 hodin byla retence stabilní (RSD < 0,28 %), plocha píků RSD v průměru 5,3 %, asymetrie ~1,1 a FWHM 3,3 s.
• Carry-over < 0,14 % složeno z přibližně 0,07 % systémového a 0,07 % kolonnového přenosu.

Přínosy a praktické využití metody

Kapilární-flow LC-MS na Vanquish Neo poskytuje kompromis mezi ultra-citlivým nano-flow a robustním vysokoprůtokovým provozem: vysoká citlivost, rychlost, reproducibilita a nízký carry-over umožňují cílené kvantifikace peptidů ve středních až velkých kohortách vzorků. Vhodné pro klinické bioanalytické aplikace, farmaceutický výzkum i rutinní QA/QC prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření multiplexních SRM/MRM metod pro simultánní detekci stovek analyzovaných peptidů.
• Integrace mikrofluidních modulů a automatizace přípravy vzorků pro vysokoprůtokové platformy.
• Použití v klinických proteomických studiích, biomarkerových validacích a farmakokinetyce.
• Další zlepšení kolonnových materiálů a ESI emitterů pro vyšší citlivost a robustnost.

Závěr

Studie prokázala, že jediná UHPLC-MS platforma (Vanquish Neo + TSQ Altis) zvládá jak nano-flow, tak kapilární-flow režimy bez konstrukčních úprav. Kapilární-flow nabízí srovnatelnou citlivost a linearitu s nano-flow, výrazně vyšší produktivitu a dlouhodobou stabilitu, což usnadňuje rutinní nasazení v náročných bioanalytických laboratořích.

Reference

1. Bian Y. et al. Nat Commun 11, 157 (2020).
2. Wilson S.R. et al. Bioanalysis 7, 1799–1815 (2015).
3. Meding S., Boychenko A. Chromatography Today 2016, 43–45.
4. Boychenko A. et al. Technical Note 72277 (2017).
5. Pitt J.J. Clin Biochem Rev 30, 19–34 (2009).
6. Hopfgartner G. et al. J. Chromatogr. A. 647, 51–61 (1993).
7. FDA Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry (2021).