Routine Single-Shot Identification of >9K Proteins and >100K Peptides with the Next-Generation Low-Flow UHPLC Coupled to HRAM MS

Význam tématu

Hloubkové proteomické profilování hraje klíčovou roli v biologickém výzkumu, klinické diagnostice a objevování biomarkerů. Efektivní separace peptidů na nanoLC úrovni a citlivá detekce pomocí vysoce rozlišené hmotové spektrometrie umožňují identifikovat tisíce proteinů v jediném běhu. Vývoj nových UHPLC systémů s ultra-vysokým tlakem a optimalizovanými kolumnami zvyšuje kapacitu, reprodukovatelnost a hloubku analýzy, čímž otevírá širší spektrum aplikací v základním i aplikovaném výzkumu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje výkonnost nové generace nízkoprůtokového UHPLC systému Vanquish Neo ve spojení s Orbitrap Exploris 480 MS pro jednorázové bottom-up proteomické analýzy HeLa buněčného digestu. Cílem bylo demonstrovat:

• Maximální identifikaci peptidů a proteinů při gradientech 180 a 240 minut
• Vliv délky kolony (50 vs. 75 cm) a průtoku na separační účinnost
• Reprodukovatelnost výsledků napříč více kolónami
• Optimalizaci MS parametrů pro zpracování chimerických spekter

Použitá metodika a instrumentace

Pro experimenty byl použit vzorek komerčně dostupného HeLa digestu, připravený v 0,1 % formiové kyselině. NanoLC separace probíhala na:

• Vanquish Neo UHPLC systém s ultra-vysokotlakou pumpou (až 1500 bar)
• EASY-Spray PepMap Neo kolony: 75 μm ID × 50 cm a 75 μm ID × 75 cm
• Proud 200–500 nL/min a gradient 90–240 minut

Detekce byla zajištěna Orbitrap Exploris 480 v režimu data-dependent acquisition (DDA). Data zpracována v Proteome Discoverer 2.5/3.0 se 2-krokovým Sequest HT vyhledáváním a INFERYS rescoringem, včetně řešení chimerických spekter.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýzy ukázaly, že 75 cm kolony poskytují vyšší špičkovou kapacitu a zúžené šířky špiček (FWHM) ve srovnání s 50 cm kolony, což vedlo k identifikaci více než 9 000 proteinových skupin a přes 100 000 peptidů při gradientu 180–240 minut a 2 μg náložce.
Vliv průtoku na citlivost byl měřen mezi 200 a 500 nL/min: nižší průtoky zlepšily signál intenzity MS1 až o 40 %, aniž by došlo k omezení počtu MS/MS událostí či PSM.
Reprodukovatelnost eluce na čtyřech různých kolónách zůstala v rámci 5 % pro peptidy a 1 % pro proteiny. Zpracování chimerických spekter vedlo k významnému nárůstu identifikací bez prodloužení doby analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

Nová UHPLC-MS platforma umožňuje:

• Jednorázové „deep-dive“ DDA běhy s vysokou hloubkou pokrytí proteomu
• Vysoce reprodukovatelné výsledky napříč kolónami a běhy
• Flexibilní nastavení délky gradientu a průtoku pro různé druhy vzorků
• Efektivní analýzy ve velkých vzorkových kohortách s kontinuálním QA/QC

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se, že ultra-dlouhé nano kolony (≥75 cm) ve spojení s ještě vyšším tlakem (>1500 bar) umožní další prohloubení proteomických profilů. Integrace iontových mobility zařízení či paralelních akvizičních režimů (DIA) přispěje k vyšší kvantitativní přesnosti a pokrytí nízko abundantních proteinů. Rozvoj automatizovaných workflow a pokročilých algoritmů pro zpracování chimerických spekter dále zvýší výtěžnost dat.

Závěr

Studie prokázala, že Vanquish Neo UHPLC systém s Orbitrap Exploris 480 a PepMap Neo kolony dosahuje špičkových výsledků v jednorázovém bottom-up proteomickém profilování. Díky vynikající separační účinnosti, vysoké citlivosti a výborné reprodukovatelnosti lze tuto platformu úspěšně uplatnit v širokém spektru výzkumných i průmyslových aplikací.

Reference

1. Zheng R. et al. Vanquish Neo UHPLC system sets new performance standards for single-shot nanoLCMS bottom-up proteomics. TN74152 (2021).