LC-MS: Robust long-term Vanquish Neo UHPLC system operation enabling high-performance high-pressure nanoLC separations

Význam tématu

Analýza proteomických vzorků metodou nanoLC-MS s dlouhými separačními kolónami a gradienty je klíčová pro hloubkové studium proteinových směsí. Přestože poskytuje vysokou citlivost a rozlišení, její běžné nasazení brzdí obavy o dlouhodobou robustnost a reprodukovatelnost. Moderní UHPLC přístroje s možností práce při vysokém tlaku a řízeným tokem nabízejí řešení těchto výzev a umožňují rutinní provoz v náročných aplikacích bottom-up proteomiky.

Cíle a přehled studie

Studie hodnotí schopnost systému Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC provádět 1600 po sobě jdoucích analýz trvajících 176 dnů bez výměny kolóny. Pro separaci byl použit BSA protein digest na kolóně PepMap Neo (75 μm × 50 cm, 2 μm částice) při průtoku 300 nL/min a 90minutovém gradientu. Cílem bylo ověřit stabilitu retenčních časů, šířku špiček a tlakové profily při plném využití 1500 bar provozního tlaku.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: digest bovinního sérového albuminu v koncentraci 1 pmol/μL připravený v 0,1 % kyselině mravenčí

• UHPLC systém: Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC
• Kolóna: Thermo Scientific PepMap Neo 75 μm × 500 mm, 2 μm, 1500 bar
• Pumpa a autosampler s funkcí SmartInject, rychlým nahráváním a ekvilibrací při 1500 bar
• Detektor: UV absorpční měření při 214 nm
• Řídicí software: Chromeleon Chromatography Data System verze 7.2.10 MUd

Separace: lineární gradient 6–35 % organické fáze během 60 minut, kolóna temperována na 50 °C, autosampler na 7 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Retenční časy osmi vybraných peptidů zůstaly stabilní s méně než 0,3min standardní odchylkou po každých 100 vteřinách analýz. Šířky špiček (FWHM) nevykázaly žádný systematický nárůst po 1600 vstupech. Průběžný tlak na kolóně se pohyboval v rozmezí ±25 bar vůči hodnotě při 300 nL/min, což svědčí o minimálním zanášení a vynikající mechanické stabilitě.

Přínosy a praktické využití metody

Demonstrace dlouhodobé stability a reprodukovatelnosti nanoLC-MS analýz otevírá cestu k:

• rutinnímu vysokoobjemovému zpracování proteomických vzorků
• šetrnému využití vzorku při nízkých průtocích
• minimalizaci prostojů a údržby díky řízenému nahrávání a ochranným filtrům

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování zahrnuje integraci UHPLC s vysokorozlišenými hmotnostními spektrometry pro prohloubenou kvantitativní analýzu, rozvoj automatizovaných pracovních postupů a využití v metrologii, farmaceutickém vývoji a klinické proteomice. Zvýšený tlak a inteligentní řízení toku slibují zkrácení cyklů a ještě vyšší citlivost.

Závěr

Technická poznámka prokázala, že systém Vanquish Neo UHPLC ve spojení s PepMap Neo kolónou poskytuje dlouhodobou chromatografickou robustnost a konzistentní separační výkon při nano-LC provozu pod vysokým tlakem. Vynikající stabilita retenčních časů, šířek špiček a tlakových profilů potvrzuje vhodnost pro náročné proteomické aplikace.

Reference

Pynn C a kol. Robust long-term Vanquish Neo UHPLC system operation enabling high-performance high-pressure nanoLC separations. Thermo Fisher Scientific Technical Note 2021