Determination of Proteins and Carbohydrates by 2D HPLC (RPLC and HILIC) with Charged Aerosol and Ultraviolet Detection

Význam tématu

Biotechnologická léčiva a vakcíny často obsahují kromě terapeutických proteinů také sacharidy jako excipienty pro stabilizaci a úpravu vlastností formulace. Spolehlivá kvantifikace obou složek je klíčová pro kontrolu kvality a bezpečnost léčiv. Dvojrozměrná chromatografie kombinuje výhody reverzní fáze (RPLC) pro proteiny a hydrofilní interakční chromatografii (HILIC) pro sacharidy, což umožňuje simultánní analýzu v jedné metodě a minimalizuje čas i spotřebu vzorků.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a ověřit 2D HPLC metodu schopnou současně oddělit a kvantifikovat bovinní sérový albumin (BSA) jako model proteinu a sedm běžných sacharidů (sorbitol, mannitol, glukóza, sacharóza, laktóza, maltóza, trehalóza) v biofarmaceutickém vzorku. Metoda byla testována na rozsahu koncentrací od jednotek do tisíců ng na kolonu a optimalizovány detektory Corona Charged Aerosol Detector (CAD) a UV detekce.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek se nejprve injektuje na RPLC kolonu (Shodex Asahipak ODP-402D) pro retenci proteinu a neudržení sacharidů. Sacharidy jsou sbírány do 500 µl smyčky a smíchány s acetonitrilem pro přechod na HILIC kolonu (Shodex HILICpak VG-504E) v druhé dimenzi. Protein je poté eluován z RPLC fáze v gradientu a detekován UV při 214 a 280 nm a CAD. Sacharidy jsou eluovány z HILIC fáze v samostatném gradientu a detekovány CAD.

• HPLC systém: Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 DGP-3600SD, WPS-3000RS, TCC-3000RS
• Ventil: 2-polohový, 10portový
• RPLC kolona: Shodex Asahipak ODP-402D (C18 polymerní)
• HILIC kolona: Shodex HILICpak VG-504E
• Detekce proteinů: DAD (214, 280 nm) a CAD (Corona Veo SD)
• Detekce sacharidů: CAD (Corona Veo SD)
• Software: Chromeleon Chromatography Data Station 7.2 SR11

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokazuje kvantitativní stanovení BSA a všech sedmi sacharidů s vynikající linearitou (R² > 0,997). LOD pro sacharidy dosahuje 4–9 ng na kolonu, LOQ 14–29 ng. Pro protein byl LOQ 12 ng pomocí CAD a 79 ng při UV 280 nm, což ukazuje pětinásobně vyšší citlivost CAD pro BSA. Mezi injekcemi byla dosažena preciznost 0,3–4,4 % RSD. Úspěšné recoveries sacharidů se pohybovaly v rozmezí 97,5–101,3 % a pro BSA 96 % (CAD) a 101,9 % (UV). Sedm sacharidů v kombinacích se oddělilo s dostatečným rozlišením; částečný překryv sorbitolu, mannitolu a glukózy neovlivňuje běžné formulace.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Rychlou a přesnou kontrolu kvality biofarmaceutických formulací obsahujících proteiny a sacharidy.
• Úsporu času a rozpouštědel díky simultánní analýze v jednom běhu.
• Vyšší citlivost a pevnější integrační bázi díky CAD ve srovnání s UV pro proteiny.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují:

• Implementaci jednoduššího uspořádání s jediným CAD detektorem pro finální rutinní analýzu.
• Rozšíření na další třídy excipientů (aminokyseliny, lipidy).
• Integraci se softwarem pro automatizovanou validaci a reporting v souladu s regulacemi GMP.
• Možnost aplikace v on-line monitoringu výrobního procesu a stabilitních studiích.

Závěr

Vyvinutá 2D HPLC-RPLC/HILIC metoda s CAD a UV detekcí poskytuje robustní, citlivé a přesné stanovení proteinu a sedmi sacharidů v biopharma formulacích. CAD výrazně zlepšuje citlivost pro proteiny a zároveň umožňuje spolehlivou detekci sacharidů, což otevírá cestu k efektivní kontrole kvality komplexních léčivých přípravků.