Increasing throughput of native SEC-MS in biopharmaceutical development using a tandem UHPLC setup

Význam tématu

V rané fázi vývoje biofarmaceutik je klíčové rychle a spolehlivě identifikovat optimální kandidáty na monoklonální protilátky. Metoda SEC-MS za nativních podmínek umožňuje současnou analýzu agregace a přesné stanovení intact masy, čímž šetří čas i vzorek a zachovává biologickou konformaci molekul.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované aplikace bylo demonstrovat zvýšení propustnosti (throughput) natívní SEC-MS pomocí tandemového UHPLC uspořádání (Vanquish Duo) spojeného s orbitrapovou hmotnostní spektrometrií (Q Exactive Plus s BioPharma Option). Studie se zaměřila na analýzu 384 vzorků mAb během výběru slibných kandidátů a porovnání s tradičním postupem SEC + RP LC-MS.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky se bez další přípravy aplikovaly přímo na kolonu pro SEC (4,6 × 150 mm, 1,7 µm) v isokratickém režimu mobilní fáze (25 mM acetát pH 5,4). Analytický tok 0,3 mL/min udržoval teplotu kolony na 20 °C a autosampler na 5 °C. Pro tandem LC-MS bylo použito:

• Thermo Scientific Vanquish Duo UHPLC systém pro Tandem LC-MS
• Thermo Scientific Q Exactive Plus hybridní kvadrupól-Orbitrap s BioPharma Option
• Chromeleon CDS v7.2.9 s modulem Intact Protein Deconvolution

Hlavní výsledky a diskuse

Během jedné sekvence 423 injekcí (384 kandidátů + 17 SST) bylo dosaženo:

• RSD retence monomeru < 0,04 % a RSD relativního podílu vrcholu monomeru 0,19 %
• Mód massové odchylky SST vzorku ±1,5 Da (±10 ppm)
• Zkrácení doby analýzy ze 23 min na 4,7 min na vzorek – 5× zvýšení propustnosti
• Snížení spotřeby vzorku ze 15 µg na 10 µg

Orbitrapová detekce poskytla vynikající rozlišení izotopových vzorců a nízký šum, což usnadnilo dekonvoluci bez významné degradace kvality spekter.

Přínosy a praktické využití metody

V jednom běhu poskytuje natívní SEC-MS informaci o agregaci (UV detekce) a o intact masách hlavních glykoforem a variant (MS). Tento integrovaný přístup:

• Umožňuje rychlou selekci lead kandidátů
• Snižuje náklady a spotřebu vzorku
• Je přenositelný do QC prostředí pro validované ID testy

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření tandemových natívních LC-MS aplikací na iontovou výměnu či afinitní chromatografii, automatizace přípravy vzorků a nasazení pokročilých algoritmů (strojové učení) pro rychlejší zpracování a interpretaci proteoformních dat. Dále je předpoklad adaptace pro další třídy bioléčiv, např. rekombinantní proteiny či vakcíny.

Závěr

Implementace natívní SEC-MS na tandemovém UHPLC přinesla pětinásobné zkrácení doby analýzy a významné snížení spotřeby vzorku při zachování vysoké přesnosti retenční doby, nízkého RSD a vynikající masové přesnosti. Platforma se osvědčila jako spolehlivý nástroj pro výběr a charakterizaci biofarmaceutických kandidátů.

Reference

• Füssl F., et al. Comprehensive characterisation of the heterogeneity of adalimumab via charge variant analysis hyphenated on-line to native high resolution Orbitrap mass spectrometry. MAbs. 2018;10(6):901–912. doi:10.1080/19420862.2018.1531664
• Scheffler K., Damoc E. Full characterization of heterogeneous antibody samples under denaturing and native conditions on the Q Exactive BioPharma mass spectrometer. Thermo Fisher Scientific Application Note 72348. 2017.
• Bailey A.O. The Quest for Highly Effective Resolution: Therapeutic Protein Characterization via Separations-Coupled Native MS. C&EN Whitepaper. 2018.