Analysis of underivatized amino acids in wines by solid phase extraction and HILIC-MS

Význam tématu

Aminokyseliny tvoří 30–40 % dusíkatého obsahu vína a výrazně ovlivňují jeho organoleptické vlastnosti a kvalitu. Jejich spolehlivá analýza v komplexní matrici vína je však ztížena přítomností organických kyselin, polyfenolů, lipidů a proteinů. Vypracování robustní metody pro kvantifikaci nederivovaných aminokyselin je klíčové pro enologický výzkum, kontrolu kvality a lepší pochopení vlivu odrůdy, terroiru či technologických parametrů výroby vína.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat jednoduchou a opakovatelnou proceduru čistění vzorků vína pomocí solid phase extraction (SPE) na materiálu HyperSep C18, která odstraní interferující matrixové složky a současně obohatí nederivované aminokyseliny. Následná separace na HILIC kolóně a detekce v režimu single ion monitoring (SIM) na singl-kvadru pólu hmotovém spektrometru měla zajistit vysokou citlivost, linearitu a dobrou opakovatelnost pro 17 cílových aminokyselin.

Použitá metodika

Vzorky bílého a červeného vína (celkem šest vzorků z různých odrůd a ročníků) byly naředěny 0,1 N HCl (1 mL vzorku + 2 mL 0,1 N HCl v 70/30 vodě/metanolu) a aplikovány na SPE kazetu HyperSep C18 (1000 mg/6 mL). Kartouše byly kondicionovány metanolem, vodou s 0,1 N HCl a 0,1 N HCl v 80/20 vodě/metanolu. Během aplikace vzorku se retenovaly interferující hydrofobní látky, zatímco polární aminokyseliny procházely eluátem. Pro zvýšení recovery byl použit dodatečný ohmyt kyselým vodno-metanolovým roztokem. Eluát se po promíchání injektoval přímo do UHPLC-MS systému.
Separace proběhla na kolóně Accucore 150 Amide HILIC (2,1 × 150 mm, 2,6 µm) s mobilními fázemi A (acetonitril/ammonium formát pH 2,8, 90/10) a B (voda/ammonium formát pH 2,8, 90/10). Gradientní eluce (0–30 min) při průtoku 0,4 mL/min a kolónové teplotě 30 °C zajistila rozdělení aminokyselin, které byly detekovány v režimu SIM (pozitivní i negativní ESI) na Thermo Scientific ISQ EM.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Flex Quaternary UHPLC
• Thermo Scientific ISQ EM Single Quadrupole Mass Spectrometer
• Accucore 150 Amide HILIC kolóna (2,1 × 150 mm, 2,6 µm)
• Thermo Scientific HyperSep C18 SPE materiál (1000 mg/6 mL)
• Pomůcky pro manipulaci se vzorky: centrifuga, vortex, pH metr, pipety

Hlavní výsledky a diskuse

Pro 17 aminokyselin byl dosažen lineární rozsah 1–500 µM, koeficient determinace R² > 0,997 a opakovatelnost < 0,1 % RSD pro retenční časy a < 2,6 % RSD pro plochy (kromě Asp, Glu, Hyp). SPE ukázala precizitu ploch RSD < 6 % a recovery 71–113 %. Ve všech vzorcích byly detekovány cílové aminokyseliny kromě prolinu, který překročil kalibrační rozsah, a u Arg, His a Lys bylo upozorněno na maticové efekty vyžadující izotopově značené interní standardy. Prolin se ukázal jako nejhojnější ve všech zkoumaných vínech. Bílá vína vykazovala obecně vyšší hladiny leucinu a tyrosinu než červená.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a reprodukovatelná příprava vzorků účinně odstraňující matrixové interferenty
• Stanovení nederivovaných aminokyselin bez komplikovaných derivatizací
• Vysoká citlivost a selektivita díky režimu SIM na MS
• Vhodné pro rutinní i výzkumné enologické laboratoře (QA/QC, profilování vín)

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření o izotopově značené interní standardy pro eliminaci maticových efektů, automatizace SPE kroků a integrace s vysoce rozlišujícím HRMS otevře cestu k širším metabolomickým studiím. Vývoj rychlých HILIC kolón a mikrospe SPE formátů slibuje zkrácení doby analýzy a vyšší propustnost laboratoří.

Závěr

Kombinace SPE na HyperSep C18 a HILIC-MS v režimu SIM se osvědčila jako robustní a přenosná metoda pro stanovení nederivovaných aminokyselin ve víně s vynikající citlivostí, linearitou a opakovatelností. Metoda je vhodná pro široké spektrum analytických úloh v enologii.

Reference

1. Lehtonen P. Determination of amines and amino acids in wine – A review. American Journal of Enology and Viticulture 1996;47:127–133.
2. de Villiers A., Lynen F., Crouch A., Sandra P. Determination of polyphenols, organic acids and sugars in wine. Chromatographia 2004;59:403–409.
3. Thermo Fisher Scientific. Application Note 20583: Determination of catechins and phenolic acids in red wine by solid phase extraction and HPLC. Thermo Fisher Scientific; 2020.
4. Sanders EM, Ough CS. Determination of free amino acids in wine by HPLC. American Journal of Enology and Viticulture 1985;36:43–46.
5. Thermo Fisher Scientific. Application Note 73151: Underivatized amino acid analysis in wine by HILIC separation and mass detection. Thermo Fisher Scientific; 2020.
6. Soufleros EH, Bouloumpasi E, Tsarchopoulos C, Biliaderis CG. Primary amino acid profiles of Greek white wines and their use in classification according to variety, origin and vintage. Food Chemistry 2003;80:261–273.
7. Etievant P, Schlich P, Bouvier JC, Symonds P, Bertrand A. Varietal and geographic classification of French red wines in terms of elements, amino acids and aromatic alcohols. Journal of the Science of Food and Agriculture 1988;45:25–41.
8. Rodriquez P, Borrull F, Guasch J. Free amino acid content of varietal white wines from the Tarragona region. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung 1988;186:524–525.