Impurity profiling of the synthetic peptide LL-37 using high-performance liquid chromatography with combined UV and single quadrupole mass spectrometric detection

Význam tématu

Analýza nečistot syntetických peptidů, jako je LL-37, je zásadní pro zajištění bezpečnosti a účinnosti API. Rychlé a spolehlivé metody umožňují odhalit nízko koncentrované a strukturně podobné vedlejší produkty vznikající při SPPS.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou UHPLC metodu s kombinací UV a single quadrupole MS detekce pro:

• kvantitativní stanovení hladin impurit peptidu LL-37 pomocí UV detekce
• identifikaci produktově vázaných impurit pomocí MS
• ověření schopnosti detekce nízko nabitých peptidových forem díky rozšířenému m/z rozsahu do 2000

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Kolona: Thermo Scientific Acclaim RSLC 120 C18 (50×2.1 mm, 2.2 μm)
• Mobilní fáze: A (H₂O + 0.1 % kys. mravenčí), B (ACN + 0.1 % kys. mravenčí)
• Gradient: 0–50 % B za 2 min., návrat na 20 % B v 2,1 min
• Flow rate: 0,5 mL/min, teplota kolony: 50 °C, injekce 1 μL
• UV detekce při 214 nm, data rate 10 Hz
• MS detekce: Thermo Scientific ISQ EM, Full Scan pozitivní ionizace, m/z 500–2000
• Datový systém: Chromeleon 7.2.9

Instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Flex Binary UHPLC
• Thermo Scientific ISQ EM single quadrupole MS
• Acetonitril a kys. mravenčí Optima LC/MS
• Deionizovaná voda 18,2 MΩ·cm

Hlavní výsledky a diskuse

• UV chromatogram LL-37 nevykazoval zjevné impurity, MS však odhalil kompletní profil nabitých forem (2–8)
• Dekonvoluce intactní hmotnosti dosáhla odchylky ≤0,5 Da oproti teoretické masě
• Simulace impurit: fragmenty LL-37 SKE a RKS baseline separovány do 2 min (RT 0,9 a 1,2 min)
• Srovnání relativních ploch UV, TIC a XIC ukázalo odchylky v kvantifikaci a podtrhlo význam MS pro přesnou identifikaci

Přínosy a praktické využití metody

• Kombinace UV a MS zvyšuje spolehlivost impurity profilu a potvrzení struktury
• Rychlá analýza do 2 minut šetří čas v QC laboratořích
• Rozšířený m/z rozsah umožňuje detekovat nízko nabité peptidové formy

Budoucí trendy a možnosti využití

• Nasazení cílených MS/MS metod a vysokého rozlišení pro detailní strukturální charakterizaci
• Kvantitativní analýza s izotopově značenými standardy
• Integrace s automatizovanými SPPS systémy pro on-line QC

Závěr

Metoda UHPLC-UV-MS s ISQ EM poskytuje rychlý a robustní nástroj pro impurity profiling syntetického peptidu LL-37. Kombinace komplementárních detekčních technik umožňuje kvalitní kontrolu výroby a důvěryhodné potvrzení identity nežádoucích vedlejších produktů.

Reference

1. Wu LC, Chen F, Lee SL, Raw A, Yu LX. Building parity between brand and generic peptide products: Regulatory and scientific considerations for quality of synthetic peptides. Int J Pharmaceutics. 2017;518:320–334.
2. Chen Y, Yang S, Ho EA. Development of an Analytical Method for the Rapid Quantitation of Peptides Used in Microbicide Formulations. Chromatographia. 2014;77(23-24):1713–1720.
3. ICH Guidelines, Quality Guidelines, Q3A–Q3D Impurities.