Comparison of quantitative eicosanoids profiling in human plasma and serum by ultra-fast multiple reaction monitoring

Význam tématu

Profilování eikosanoidů pomocí MRM hraje klíčovou roli při odhalování fyziologických procesů a hledání biomarkerů zánětlivých onemocnění. Rychlá a komplexní analýza desítek kyselin arachidonové a omega‐3 mastných kyselin v lidské krvi přináší cenné informace o rozdílech mezi plazmou a sérem a umožňuje lepší diagnostiku, výzkum a kontrolu kvality laboratoří.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo srovnat kvantitativní profil 68 eikosanoidů a souvisejících metabolitů v EDTA plazmě, heparinové plazmě a séru člověka. Autoři navrhli MRM metodu schopnou monitorovat 196 mastných kyselin a vyvinuli nástroj pro vizualizaci dat na metabolické mapě, což umožnilo snadno odlišit enzymatické dráhy a kvantitativní rozdíly mezi vzorky.

Použitá metodika

• Příprava vzorku: 30 µL plazmy nebo séra promícháno s 300 µL methanolu (0,1 % kyseliny mravenčí) a 10 µL směsi 18 interních standardů, odstředění, SPE na STRATA-X (10 mg).
• Suchá extrahovaná fáze rekonstituována v 30 µL methanolu, z nichž 5 µL injikováno do LC/MS.
• Kvantifikace v trojitém opakování každého vzorku.
• Chromatografie: RP Kinetex C8, 2,1×150 mm, 2,6 µm, doba analýzy 20 minut.
• MS: ultra-rychlý triple quad LCMSTM-8060NX, MRM režim s rychlým přepínáním polarity (negativní pro většinu mastných kyselin, pozitivní pro ethanolamidy).

Použitá instrumentace

• NexeraTM UHPLC systém (Shimadzu)
• LCMS-8060NX triple kvartupól (Shimadzu)
• KinetexTM C8 analytický sloupec (Phenomenex)
• STRATA-X 10 mg SPE kazeta (Phenomenex)

Hlavní výsledky a diskuse

Celkem bylo v lidských vzorcích detekováno 68 eikosanoidů. V plazmě (EDTA a heparin) se objevilo 67 cílů, v séru 44. Kvantifikace 31 metabolitů kyseliny arachidonové proběhla pomocí poměru k internímu standardu (1000× poměr ploch).
Porovnání plazmy a séra ukázalo vyšší koncentraci prekurzorů (např. AA, EPA, DHA) v séru, zatímco většina metabolitů (LOX produkty, HETEs) byla výrazně vyšší v plazmě, zejména v heparinové. TXB2 nebyl detekován v plazmě, což dokládá inhibici agregace trombocytů EDTA i heparinem. COX produkty (PGE2, PGD2) byly zachovány v plazmě, CYP produkty (DHETs, carboxy-AA) se nelišily statisticky významně.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou (20 min) a citlivou detekci desítek eikosanoidů v klinických i výzkumných vzorcích. Vizualizace dat na metabolické mapě usnadňuje identifikaci enzymatických drah, podporuje objev biomarkerů a zefektivňuje QA/QC postupy v průmyslové analytice a farmacokinetice.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření na širší spektrum lipidů, integrace s omics daty a umělou inteligencí pro hlubší analýzu dat. Další vývoj se zaměří na miniaturizaci, automatizaci přípravy vzorků a zvýšení citlivosti MS, což otevře cestu k personalizované medicíně a bodové diagnostice.

Závěr

Představená MRM metoda a nový software pro zobrazení metabolických map umožnily komplexní kvantifikaci 68 eikosanoidů v lidské plazmě a séru. Rozdíly mezi EDTA plazmou, heparinovou plazmou a sérem poskytují cenné informace o koagulačních a zánětlivých mechanismech a podporují další výzkum v oblasti lipidové metabolomiky.

Reference

• Yamada M. et al., J. Chromatography B, 995, 74-84 (2015).