IDENTIFIKACE A CHARAKTERIZACE ISOFLAVONŮ V ROSTLINNÝCH EXTRAKTECH ZA POUŽITÍ KOMBINACE HPLC S HMOTNOSTNÍM DETEKTOREM A DETEKTOREM S DIODOVÝM POLEM (HPLC-DAD-MS)

Význam tématu

Rostlinné isoflavony představují významnou skupinu bioaktivních fenolických sekundárních metabolitů s klíčovou rolí v obraně rostlin proti patogenům a stresovým podmínkám. Navíc vykazují fytoestrogenní účinky u savců a ovlivňují mikrobiální dynamiku v půdě, což zvyšuje jejich význam pro fytochemii, lékařský výzkum i potravinářský průmysl.

Cíle a přehled studie

Práce se zaměřuje na optimalizaci extrakce, separace a identifikace isoflavonů v rostlinných extraktech kombinací kapalinové chromatografie s diodovým polem (DAD) a hmotnostní spektrometrie (MS). Metoda byla demonstrována na extraktu jeteloviny Trifolium pratense, kde bylo cílem odhalit a charakterizovat aglykony, glykosidy, malonáty a acetáty.

Použitá metodika a instrumentace

• Extrakce kapalnými rozpouštědly (methanol, ethanol, acetonitril) s následující SPE očistou a případnou SFE (nadkritický CO₂).
• Chromatografie: reverzní fáze C18/C8 s izokratickou či gradientní elucí (směsi methanolu, acetonitrilu, pufrů octanových, trifluoroctových).
• Detekce: UV/VIS diodové pole (220–380 nm) a hmotnostní spektrometrie HPLC/ESI-MS a HPLC/APCI-MS s kolizní (RDA) fragmentací.

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo identifikováno 36 píků v extraktu Trifolium pratense: aglykony (např. daidzein, genistein), glykosidy, malonylglukosidy i acetylglukosidy. Kombinace retenčních časů, UV spekter a MS/MS fragmentace umožnila jednoznačnou identifikaci substitučních vzorců. Diskuse zdůrazňuje přínos SPE pro redukci matrix efektu a význam RDA fragmentace při určování polohy substituentů na jádru isoflavonu.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká selektivita a citlivost analýzy komplexních rostlinných extraktů.
• Redukce interferencí od rušivých složek a zjednodušení chromatogramů.
• Možnost rutinní aplikace v potravinářství, farmaceutickém QA/QC a ekologických studiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace online technik (HPLC-NMR), rozvoj mikrofluidních platforem a kapilární elektroforézy (CE-MS), rozšíření spektrálních databází a aplikace v metabolomice a fenomice. Automatizace přípravy vzorků a vyšší resoluce detekčních metod podpoří pokročilé studie biosyntézy i biologických účinků.

Závěr

Kombinace selektivní extrakce SPE a HPLC-DAD-MS představuje robustní a spolehlivou metodu pro detailní identifikaci a kvantifikaci isoflavonů v rostlinných matricích. Postup umožňuje rutinní analýzu složitých vzorků a přispívá k dalšímu výzkumu funkce a biosyntézy těchto biologicky aktivních látek.

Reference

1. Jung W., Yu O., Lau S.-M. C., O'Keefe D. P., Odell J., Fader G., McGonile B.: Nat. Biotechnol. 18, 208 (2000).
2. He X.-Z., Dixon R. A.: Plant Cell 12, 1689 (2000).
3. Dixon R. A.: Comprehensive Natural Products Chemistry I, Elsevier, Amsterdam 1999, p. 773.
4. Shirley B. W.: Seed Sci. Res. 8, 415 (1998).
5. Bruneton J.: Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants, Lavoisier, Paris 1996.
6. Williams C. A., Harborne J. B.: Methods in Plant Biochemistry I, Academic Press, London 1989.
7. Cassidy A., Bingham S., Setchell K. D. R.: Am. J. Clin. Nutr. 60, 333 (1994).
8. Ingram D., Sanders K., Kolybaba M., Lopez D.: Lancet 350, 990 (1997).
9. He X.-G.: J. Chromatogr., A 880, 203 (2000).
10. Stobiecki M.: Phytochemistry 54, 237 (2000).
11. Hostettman K., Wolfender J. L., Rodriguez S.: Planta Med. 63, 2 (1997).
12. Barnes S., Kirk M., Coward L.: J. Agric. Food Chem. 42, 2466 (1994).
13. Aramendia M. A., García I., Lafont F., Marinas J. M.: J. Chromatogr., A 707, 327 (1995).
14. Franke A. A., Custer L. J., Cerna C. M., Narala K. K.: J. Agric. Food Chem. 42, 1905 (1994).
15. Peterson H., Kiessling K. H.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 67, 503 (1984).
16. Bouvier E. S. P., Martin D. M., Iraneta P. C., Capparella M., Cheng Y.-F., Phillips D. J.: LC-GC 15, 152 (1997).
17. Cheng Y.-F., Neue U. D., Bean L.: J. Chromatogr., A 828, 273 (1998).
18. Cheng Y.-F., Phillips D. J., Neue U. D., Bean L. L.: J. Liq. Chromatogr. 20, 2461 (1997).
19. Klejdus B., Vitamvásová D., Kubáň V.: J. Chromatogr., A 839, 261 (1999).
20. Klejdus B., Kubáň V.: Phytochem. Anal. 11, 375 (2000).
21. Klejdus B., Tináctý J., Hrdlička P., Kubáň V.: Chem. Pap. 55, 285 (2001).
22. Klejdus B., Vitamvásová D., Kubáň V.: Anal. Chim. Acta 450, 81 (2001).
23. Fritz J. S., Macka M.: J. Chromatogr., A 902, 137 (2000).
24. Neue U. D.: Am. Lab. 1997(2), 334.
25. Bolliet D., Poole C. F.: Chromatographia 46, 381 (1997).
26. Verotta L., Peterlongo F.: Phytochem. Anal. 4, 178 (1993).
27. Mabry T. J., Markham K. R., Thomas M. B.: The Systematic Identification of Flavonoids, Springer-Verlag, New York 1970.
28. Balogh M. P.: LC-GC 15, 456 (1997).
29. Wolfender J. L., Rodriguez S., Hostettmann K., Wagner-Redeker W.: J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. S35–S46 (1995).
30. He X.-G., Lin L.-Z., Lian L.-Z.: J. Chromatogr., A 755, 127 (1996).
31. Stobiecki M., Malosse C., Kerhoas L., Wojtaszek P., Einhorn J.: Phytochem. Anal. 10, 198 (1999).
32. Summer L. W., Paiva N. L., Dixon R. A., Geno P. W.: J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 31, 472 (1996).
33. Barnes S., Coward L., Kirk M., Sfakianos J.: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 254 (1998).
34. Lin L.-Z., He X.-G., Lindenmaier M., Nolan G., Yang J., Cleary M., Qiu S.-X., Cordell G. A.: J. Chromatogr., A 876, 87 (2000).
35. Lin L.-Z., He X.-G., Lindenmaier M., Yang J., Cleary M., Qiu S.-X., Cordell G. A.: J. Agric. Food Chem. 48, 354 (2000).
36. Satterfield M., Black D. M., Brodbelt J. S.: J. Chromatogr., B 759, 33 (2001).
37. Griffith A. P., Collison M. W.: J. Chromatogr., A 913, 397 (2001).
38. Wang J., Sporns P.: J. Agric. Food Chem. 48, 5887 (2000).
39. Choi Y. S., Row K. H.: J. Liq. Chromatogr. 23, 1671 (2000).
40. de Rijke E., Zafra-Gómez A., Ariese F., Brinkman U. A. T., Gooijer C.: J. Chromatogr., A 932, 55 (2001).