ANALYTICKÉ METODY STUDIA CYTOKININŮ

Význam tématu

Analýza cytokininu je klíčová pro pochopení regulace růstu a vývoje rostlin. Cytokininy patří mezi pět hlavních skupin fytohormonů a v rostlinných pletivech se vyskytují v extrémně nízkých koncentracích (fmol–pmol/g čerstvé hmoty). Jejich stanovení je proto analyticky náročné – vyžaduje citlivé a vysoce selektivní metody spojené s účinnými očistnými postupy.

Cíle a přehled studie / článku

Článek shrnuje a porovnává současné metody pro kvalitativní i kvantitativní analýzu cytokininů v rostlinných extraktech: od extrakce a čištění přes biotesty, chromatografické a hmotnostně-spektrometrické přístupy až po imunochemické či elektrochemické techniky.

Použitá metodika a instrumentace

Ultrapravé extrakční postupy

• Směs Bieleski (methanol–chlorofom–kyselina mravenčí–voda) pro inaktivaci fosfatas a vysokou extrakční účinnost
• Kapalina–kapalina (rozdílná rozpustnost v butanolu/vodě při různém pH)
• Extrakce tuhou fází (SPE) s hybridními sorbenty pro reverzní fázi a iontoměnič

Očistné techniky

• Imunoafinitní chromatografie (IAC) s kolonkami navázaných protilátek proti strukturálním skupinám CK
• Ionexová a imunofinitní kolona, kombinace s TLC či HPLC

Chromatografie a detekce

• Tenkovrstvá chromatografie (TLC) – levná, rychlá orientace
• HPLC (RP i normální fáze) s detekcí UV/DAD, RIA/ELISA, MS (ESI, APCI, FAB, TSI, CI)
• Kapilární a mikrokolony (0,3–2 mm i.d.) pro zkoncentrování vzorku a femtomolární citlivost
• GC/MS po derivatizaci (TMS, TFA, permethylace, acetylace, pentafluorbenzylace)

Další metody

• Biotesty (kalusový test, senescenční test) pro stanovení biologické aktivity
• Kapilární zónová elektroforéza (CZE) pro disociační konstanty, interakce s cyklodextriny
• Voltametrie na uhlíkových a rtuťových elektrodách pro elektrochemickou detekci
• Metabolické profilování (GC/MS/MS) pro sledování stovek složek současně

Hlavní výsledky a diskuse

• HPLC/ESI-MS/MS: dosahuje detekčních limitů v oblasti jednotek až desítek fmol, velmi nízké požadavky na objem vzorku (mg–g)
• GC/MS: typické LOD řádu jednotek až stovek pmol, nutnost derivatizace, vyžaduje větší množství materiálu (gramy)
• Imunochemické metody (RIA, ELISA): levné, snadno automatizovatelné, citlivost fmol–pmol, nižší selektivita bez chromatografického stupně
• IAC: výrazně zlepšuje čistotu vzorku a snižuje LOD, návratnost ~85 %
• Biotesty: vhodné pro screening a ověření biologické aktivity, kombinace s HPLC pro frakcionaci
• Ostatní techniky (CZE, voltametrie): pilotní aplikace, potenciál pro rychlé stanovení vybraných CK

Přínosy a praktické využití metody

Metody umožňují:

• Studium distribuce a dynamiky cytokininů v pletivech, buňkách i kulturách
• Screening kultivarů a genetických variant (Arabidopsis, pšenice, řepa apod.)
• Vývoj nových růstových regulátorů a hodnocení jejich účinnosti
• Podporu kvality a bezpečnosti agrochemických postupů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj kapilární LC–MS/MS a mikroinjekčních systémů pro vyšší propustnost vzorků
• Automatizace extrakce a čištění (SPE–IAC) pro sériové analýzy
• Metabolické profilování rostlinných extraktů pomocí GC/MS/MS
• Vývoj cílených elektrochemických senzorů a imunoelektrod
• Integrace biologické aktivity (biotest) s chromatografickou a MS detekcí

Závěr

Volba analytické metody závisí na cílech studie (kvalitativní identifikace vs. kvantitativní stanovení), potřebné selektivitě, citlivosti a dostupném množství vzorku. Pro rutinní kvantifikaci cytokininů je vhodná HPLC/ESI-MS/MS s IAC očistou; pro strukturální charakterizaci lze použít GC/MS; pro vysokopropustné a nákladově šetrné analýzy imunochemii. Budoucí vývoj směřuje k dalšímu snižování detekčních limitů, vyšší automatizaci a komplexnímu fenotypovému/metabolickému profilování.

Reference

1. Miller C. O., Skoog F., Von Saltza M. H., Strong F.: J. Am. Chem. Soc. 78, 1392 (1955).
2. Skoog F., Strong F. M., Miller C. O.: Science 148, 532 (1965).
3. Macháčková I., in: Fyziologie rostlin (Procházka S., Macháčková I., Krekule J., Šebánek J., ed.), kap. 8. Academia, Praha 1998.
4. Crozier A., Moritz T., in: Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones (Hooykaas P. J. J., Hall M. A., Libbenga K. R., ed.), sv. 33, kap. 1. Elsevier, Amsterdam 1999.
5. Bieleski R. L.: Anal. Biochem. 9, 431 (1964).
6. Astot C., Doležal K., Moritz T., Sandberg G.: J. Mass Spectrom. 33, 892 (1998).
7. Pacáková V., Štulík K., Vlasáková V., Březinová A.: J. Chromatogr., A 764, 331 (1997).
8. Dobrev P. I., Kamínek M.: J. Chromatogr., A 950, 21 (2002).
9. Nordström A.: osobní sdělení.
10. Holub J., Hanuš J., Hanke D. E., Strnad M.: Plant Growth Regul. 26, 109 (1998).
11. Hewett E. W., Warening P. F.: Planta 114, 119 (1973).
12. Van Staden J., Upfold S. J., Drewes F. E.: S. Afr. J. Bot. 60, 293 (1994).
13. Hradecká D., Staszková L., Doležal K., Swaczyna P., Strnad M.: International Symposium: Auxin and Cytokinin in Plant Development, Prague 1999, Book of Abstracts, S84.
14. Doležal K., Astot C., Hanuš J., Holub J., Peters W., Beck E., Strnad M., Sandberg G.: Plant Growth Regul. 36, 181 (2002).
15. Tarkowská D., Doležal K., Tarkowski P., Astot C., Holub J., Fuksová K., Schmülling T., Sandberg G., Strnad M.: Physiol. Plant. 117, 579 (2003).
16. Taverner E., Letham D. S., Wang J., Cornish E., Willcocks D. A.: Phytochemistry 51, 341 (1999).
17. Yang Y. Y., Yamaguchi I., Kato Y., Weiler E. W., Murofushi N., Takahashi N.: J. Plant Growth Regul. 12, 21 (1993).
18. Prinsen E., Redig P., Strnad M., Galís I., Van Dongen W., Van Onckelen H., in: Methods in Molecular Biology, Agrobacterium Protocols (Gertland K. M. A., Davey M. R., ed.), sv. 44, kap. 23. Humana Press, New Jersey 1995.
19. Imbault N., Moritz T., Nilsson O., Chen H. J., Bollmark M., Sandberg G.: Biol. Mass Spectrom. 22, 201 (1993).
20. Prinsen E., Redig P., Van Dongen W., Esmans E. L., Van Onckelen H. A.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 948 (1995).
21. Prinsen E., Van Dongen W., Esmans E. L., Van Onckelen H. A.: J. Chromatogr., A 826, 25 (1998).
22. Van Rhijn J. A., Heskamp H. H., Davelaar E., Jordi W., Leloux M. S., Brinkman U. A. T.: J. Chromatogr., A 929, 31 (2001).
23. Doležal K., Astot C., Moritz T., Sandberg G.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14778 (2000).
24. Morris R. O.: Plant Physiol. 59, 1029 (1977).
25. Scott I. M., Horgan R., McGaw B. A.: Planta 149, 472 (1980).
26. Most B. H., Williams J. C., Parker K. J.: J. Chromatogr. 38, 136 (1968).
27. MacLeod J. K., Summons R. E., Letham D. S.: J. Org. Chem. 41, 3959 (1976).
28. Ludewig M., Dörffling K., König W. A.: J. Chromatogr. 243, 93 (1982).
29. Hocart C. H., Wong O. C., Letham D. S., Tay S. A. B., MacLeod J. K.: Anal. Biochem. 153, 85 (1986).
30. Scott I. M., Horgan R.: Planta 161, 345 (1984).
31. Björkman P. O., Tillberg E.: Phytochem. Anal. 7, 57 (1996).
32. Hocart C. H., Wang J., Letham D. S.: J. Chromatogr., A 811, 246 (1998).
33. Tay S. A. B., MacLeod J. K., Palni L. M. S.: J. Plant Biochem. Biotechnol. 2, 105 (1993).
34. Price C. P., Newmann D. J.: Principles and Practice of Immunoassay. Stockton Press 1997.
35. Gosling J. P., Reen D. J.: Immunotechnology. Portland Press, London 1993.
36. Edwards R. (ed): Immunoassay: An Introduction. William Heinemann Medical Books, London 1985.
37. Weiler E. W.: Annu. Rev. Plant Physiol. 35, 85 (1984).
38. Morris B. A., Clifford M. N., Jackman R. (ed.): Immunoassays for Veterinary and Food Analysis. Elsevier, London 1988.
39. Hacker B., Van Vunakis H., Levine L.: J. Immunol. 6, 1726 (1972).
40. Brandon D. L., Corse J., Higaki P. C., Zavala M. A.: Plant Physiol. 63, 82 (1979).
41. Khan S. A., Humayn M. Z., Jacobs T. M.: Anal. Biochem. 83, 632 (1977).
42. Trione E. J., Krygier B. B., Banowetz G. M., Katherin J. M.: J. Plant Growth Regul. 4, 101 (1985).
43. Wang T. L., Cook S. K., Knox J. P.: Phytochemistry 26, 2447 (1987).
44. MacDonald E. M. S., Akiyoshi D. E., Morris R. O.: J. Chromatogr. 214, 101 (1981).
45. Hage D. S.: Clin. Chem. 45, 593 (1999).
46. Morris R. O., Akiyoshi D. E., MacDonald E. M. S., Morris J. W., Zaerr J. B.: in Plant Growth Substances 1982 (Wareing P. F., ed.) Academic Press, London 1982.
47. Morris R. O., Jameson P. E., Laloue M., Morris J. W.: Plant Physiol. 95, 1156 (1991).
48. Nicander B., Stahl U., Björkman P. O., Tillberg E.: Planta 189, 312 (1993).
49. Ulvskov P., Nielsen T. H., Seiden P., Marcussen J.: Planta 188, 70 (1992).
50. Barták P., Ševčík J., Adam T., Friedecký D., Lemr K., Stránský Z.: J. Chromatogr., A 818, 231 (1998).
51. Barták P., Bednář P., Stránský Z., Boček P., Vespalec R.: J. Chromatogr., A 878, 249 (2000).
52. Hernández P., Paton F., Ballesteros Y., Hernández L.: Electroanalysis 9, 235 (1997).
53. Blanco M. H., Quintana M. D., Hernández L.: Electroanalysis 12, 147 (2000).
54. Blanco M. H., Quintana M. D., Hernández L.: Fresenius’ J. Anal. Chem. 364, 254 (1999).
55. Tarkowská D., Kotouček M., Doležal K.: Collect. Czech. Chem. Commun. 68, 1076 (2003).
56. Glassbrook N., Beecher C., Ryals J.: Nat. Biotechnol. 18, 1142 (2000).
57. Müller A., Düchting P., Weiler E. W.: Planta 216, 44 (2002).
58. Birkemeyer C., Kolasa A., Kopka J.: J. Chromatogr., A 993, 89 (2003).