MaxPeak High Performance Surfaces Technology Improves HILIC Profiling of Released N-Glycans

Význam tématu

Analýza uvolněných N-glykanů je klíčová pro charakterizaci glykosylace bioterapeutik, která ovlivňuje stabilitu, účinnost a imunitní odpověď léčiv. Kyselé glykany, zejména silně sialylované či fosforylované, mají tendenci se adsorbovat na kovové povrchy chromatografických kolonek, což vede k asymetrickým píkům, nízké obnově a špatné reprodukovatelnosti. Tradiční metody passivace kolonek jsou časově náročné, vyžadují vysokou koncentraci vzorku, a často neposkytují dlouhodobě konzistentní výsledky. Technologie MaxPeak High Performance Surfaces (HPS) cílí na eliminaci nežádoucích interakcí analyta s kovovou hardware chromatografu už od prvního injektu.

Cíle a přehled studie

V aplikaci je porovnáváno chování nového ACQUITY Premier Glycan BEH Amide Column vybaveného MaxPeak HPS se standardní kovovou kolonkou při HILIC-MS analýze uvolněných N-glykanů. Studie zkoumá:

• Obnovu a tvar píků pro silně sialylované a fosforylované glykany bez předběžné passivace
• Reprodukovatelnost retencí a schopnost detekovat nízkoabundantní glykanové druhy
• Odstranění potřeby časově náročné kondicionace kolonek

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky obsahovaly standardy RapiFluor-MS Glycan Performance Test a Sialylated Glycan Performance Test, glykanové směsi uvolněné z fetuinu nebo agalsidázy. Chromatografie probíhala na systému ACQUITY Premier UPLC s HILIC kolonkou BEH Amide, separace při 60 °C s mobilní fází A (50 mM CHFO₂, pH 4,4) a B (acetonitril). Detekce FLR (Ex 265/Em 425 nm) doplněná QTof MS (ESI+, m/z 700–3000). Podrobné podmínky:

• Objem injekce 1 µL, teplota vzorku 8 °C
• Gradientní eluce na kolonce 2,1×150 mm, 1,7 µm
• MS parametry: kapilární napětí 2,2 kV, konus 75 V, desolvační teplota 500 °C

Použitá instrumentace

• ACQUITY Premier UPLC System
• ACQUITY Premier Glycan BEH Amide Column (1.7 µm, 130 Å, 2.1×150 mm)
• Xevo G2-XS QTof
• ACQUITY UPLC FLR Detector
• Software MassLynx v4.1 a UNIFI v1.8

Hlavní výsledky a diskuse

Konvenční kovová kolonka bez passivace detekovala pouze 13 z 19 glykanových druhů při první injekci, přičemž obnovy nejhojnějšího silně sialylovaného druhu klesly pod 40 % a některé druhy nebyly detekovány vůbec. Po passivaci fetuinem stoupla obnovitelnost i kapacita separace. Naproti tomu kolonka s MaxPeak HPS prokázala od prvního běhu kompletní rozlišení všech 19 glykanů, včetně low-abundant druhů (0,5 % relativní obsahu), s konstantní obnovou a efektivní peak capacity ~67. Pro fosforylované glykanové druhy (Man7-1P) poskytla HPS-kolonka cca 30 % vyšší obnovu než standardní kolonka i po její passivaci. Reprodukovatelnost retencí s HPS-kolonkou (RSD 0,12–0,22 %) byla výrazně lepší než u kovové (RSD 1,15–1,96 %).

Přínosy a praktické využití metody

Využití MaxPeak HPS významně zjednodušuje workflow pro glykanové profily, odstraňuje nutnost dlouhodobé kondicionace kolonek, zvyšuje citlivost a reprodukovatelnost analýzy kyselých glykanů a zlepšuje obnovu kritických CQAs. Metoda je plně kompatibilní s LC-ESI-MS a vhodná pro rutinní kvalitativní i kvantitativní kontrolu bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření HPS technologie na další typy kolonkových chemistrů a analytických režimů (RP, iontová výměna). Důležitým směrem je zkoumání dlouhodobé stability povrchové úpravy při vysoce komplexních bioprofilingových aplikacích a integrace do plně automatizovaných glyko-LC-MS platforem.

Závěr

MaxPeak HPS technologie v ACQUITY Premier Glycan BEH Amide poskytuje vynikající obnovu, selektivitu a reprodukovatelnost pro analýzu uvolněných N-glykanů v HILIC-MS režimu. Umožňuje bezproblémovou detekci silně sialylovaných a fosforylovaných glykanů bez časově náročné passivace kolonek, což zvyšuje robustnost a efektivitu glykoprofilace bioterapeutik.

Reference

1. Lauber MA et al. Anal Chem. 2015;87(10):5401–9.
2. DeLano M et al. Anal Chem. 2021;93(14):5773–5781.
3. Lauber MA et al. Waters White Paper 720006930EN, 2020.
4. Lauber MA et al. Waters Application Note 720005370EN, 2015.
5. Bones J et al. Anal Chem. 2011;83(13):5344–52.