PROTEOMICKÝ PRŮVODCE

Význam tématu

Proteomika se stala jedním z nejdynamičtějších oborů analytické chemie a molekulární biologie. Systematická analýza proteomu, tedy souboru všech bílkovin v buňce, tkáni nebo organismu, umožňuje pochopit složité biologické procesy, identifikovat diagnostické markery a navrhovat nová léčiva nebo biotechnologická řešení. Pokrok separačních technik, hmotnostní spektrometrie i bioinformatiky otevírá možnosti vysokého pokrytí, kvalitativní i kvantitativní analýzy bílkovin a studia jejich posttranslačních modifikací za různých fyziologických či patologických stavů.

Cíle a přehled článku

Cílem článku je shrnout a utřídit základní pojmy, přístupy a metody analytické proteomiky, které jsou představeny v rámci speciálního proteomického čísla Chemických listů. Autoři definují různé přístupy – od analytické přes strukturní, funkční a diferenční proteomiku až po high-throughput či high-coverage strategie. Dále představují tradiční i moderní metodiky přípravy vzorků, separace a identifikace bílkovin a diskutují jejich výhody a omezení.

Použitá metodika a instrumentace

• Separace bílkovin: dvourozměrná gelová elektroforéza, dvourozměrná kapalinová chromatografie, gelová chromatografie, afinitní chromatografie, field-flow frakcionace, kapilární elektroforéza s isolektrickou fokusací
• Detekce a identifikace: hmotnostní spektrometrie s ionizací MALDI a ESI, tandemová MS (MALDI-TOF/TOF, Q-TOF), peptide mass fingerprinting (PMF), fragmentační analýza peptide de novo
• Enzymatické štěpení: specifické štěpení trypsinem i nespecifické štěpení (např. proteinasa K) pro bottom-up a shotgun/MudPIT přístupy
• Bioinformatika: automatizované vyhledávací algoritmy, databázové prohledávání MS a MS/MS dat, nástroje pro kvantitativní analýzu a identifikaci posttranslačních modifikací

Hlavní výsledky a diskuse

Analytická proteomika kombinuje separaci složitých směsí bílkovin s hmotnostní spektrometrií a bioinformatickým zpracováním dat, což umožňuje rychlou identifikaci, sekvenování a detekci modifikací. Strukturní proteomika využívá krystalografii, NMR a MS k vysvětlení prostorového uspořádání bílkovin a jejich stability. Funkční a diferenční proteomika sledují role bílkovin ve složitých procesech či změny proteomu při patologických stavech. High-throughput a high-coverage přístupy maximalizují počet identifikovaných proteinů a jejich aminokyselinové pokrytí. Příprava vzorku se klade důraz na redukci složitosti, výběr vhodné frakce bílkovin a optimalizaci izolačních metod pro různé biologické materiály.

Přínosy a praktické využití metody

• Medicína: objev biomarkerů, studium mechanismů onemocnění, personalizovaná diagnóza
• Farmacie: cílený vývoj nových léčiv, screening proteinových interakcí
• Potravinářství a zemědělství: kontrola kvality potravin, vývoj odolných odrůd, sledování kontaminantů
• Průmysl a životní prostředí: výroba a optimalizace enzymů, bioremediace škodlivin

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další automatizace a miniaturizace workflows, intenzivní využití mikrofluidických platforem, hlubší integrace multi-omických dat a pokročilá kvantitativní analýza. Rozvoj instrumentace (vyšší rozlišení MS, rychlejší analyzátory) a sofistikovaných bioinformatických nástrojů umožní detailní mapování proteomu, interakcí a dynamiky posttranslačních modifikací v reálném čase.

Závěr

Proteomické metody založené na kombinaci pokročilých separačních technik, hmotnostní spektrometrie a výkonné výpočetní podpory představují klíčové nástroje pro systematickou analýzu proteomu. Jejich aplikace v medicíně, farmacii, potravinářství i průmyslu otevřela nové možnosti identifikace, kvantifikace a funkčního zkoumání bílkovin. Další technologický a bioinformatický rozvoj bude i nadále rozšiřovat jejich využití a přínos pro vědu i praxi.

Reference

• Bouchal P., Kučera I.: Chem. Listy 97, 29 (2003)
• Váňa P., Šmarda J.: Chem. Listy 98, 1130 (2004)
• Collinsová M., Jiráček J.: Chem. Listy 98, 1112 (2004)
• Cantin G. T., Yates J. R.: J. Chromatogr. A 1053, 22 (2004)
• Vollmer M., Horth P., Vad C., Nagele E.: LC GC Europe 17, 14 (2004)
• Chmelík J., Janča J.: Chem. Listy 83, 321 (1989)
• Chmelík J., Thormann W.: J. Chromatogr. 600, 305 (1992)
• Thormann W., Caslavska J., Molteni S., Chmelík J.: J. Chromatogr. 589, 321 (1992)
• Chmelík J.: Chem. Listy 93, 670 (1999)
• Kang D., Moon M.H.: Anal. Chem. 77, 4207 (2005)
• Urbánková E., Vacek A., Chmelík J.: J. Chromatogr., B 687, 449 (1996)
• Šalplachta J., Řehulka P., Chmelík J.: J. Mass Spectrom. 39, 1395 (2004)
• Madera M., Mechref Y., Novotny M. V.: Anal. Chem. 77, 4081 (2005)
• Opiteck G. J., Scheffler J. E.: Expert Rev. Proteomics 1, 57 (2004)
• Baumann M., Meri S.: Expert Rev. Proteomics 1, 207 (2004)
• Zdráhal Z., Plocek J., Konečný P., Chmelík J.: Chem. Listy 91, 811 (1997)
• Řehulka P., Chmelík J., Allmaier G.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 79 (2005)
• Kelleher N. L.: Anal. Chem. 76, 196A (2004)
• Kovářová H.: Chem. Listy 99, 886 (2005)
• Weiser J., Holub M., Nezbedová Š, Bezoušková S.: Chem. Listy 99, 890 (2005)
• Štosová T., Havliš J., Lenobel R., Šebela M.: Chem. Listy 99, 896 (2005)
• Herick K.: Chem. Listy 99, 906 (2005)
• Grym J., Foret F.: Chem. Listy 99, 915 (2005)
• Halada P.: Chem. Listy 99, 922 (2005)
• Godula M.: Chem. Listy 99, 930 (2005)
• Verner P.: Chem. Listy 99, 937 (2005)
• Boháč M., Ingendoh A., Fuchser J., Witt M.: Chem. Listy 99, 943 (2005)
• Skalníková H., Kovářová H., Moos J., Filová V., Halada P.: Chem. Listy 99, 952 (2005)
• Fella K., Glückmann M., Kruft V., Kamer P.-J., Kröger M.: Chem. Listy 99, 957 (2005)
• Zdráhal Z., Eyer L., Konečná H., Preisler J.: Chem. Listy 99, 962 (2005)
• Šalplachta J., Allmaier G., Chmelík J.: Chem. Listy 99, 967 (2005)