Label-free drug uptake analysis of whole cells by MALDI-TOF mass spectrometry using the transport protein OATP2B1 as an example

Význam tématu

Transportní proteiny, jako je OATP2B1, zásadně ovlivňují vstup a distribuci léčiv v organismu. Porozumění mechanismům jejich inhibice pomáhá předcházet nepříznivým lékovým interakcím (DDI) a optimalizovat farmakokinetiku nových i existujících terapeutik. Label-free přístupy založené na MALDI-TOF hmotnostní spektrometrii nabízejí rychlé a citlivé hodnocení buněčného uptake bez použití radiolabelů či fluorescenčních sond, čímž odstraňují omezení spojená s odpadem a artefakty.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a validovat vysokoprůchodovou celobuněčnou MALDI-MS analýzu pro detekci a kvantifikaci inhibice transportu estron-3-sulfátu (E3S) přes OATP2B1. Pilotní screening zahrnoval 294 léčiv schválených k tržnímu užití roku 2017, známých substrátů či inhibitorů OATP2B1. Kvalitativní a kvantitativní výsledky byly porovnány s údaji z fluorescenční a radiolabelové analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Buňky HEK293 přestimulované k nadprodukci OATP2B1 se kultivovaly v 96-jamkových destičkách. Po 24hodinové expozici inhibitoru (10 µM) a následné inkubaci s 10 µM E3S byly buňky promyty, rychle zmraženy a skladovány při −80 °C. Pro přípravu vzorku se na sušenou kapku nanášel matrix Ph-CCA-NH2 v 70 % acetonitrilu pomocí pipetovacího robota CyBio FeliX. Měření probíhalo na hmotnostním spektrometru rapifleX ve zpětnovazebném negativním módu (m/z 300–900) pomocí softwaru MALDI Pharma Pulse (MPP). Lineární kalibrace proběhla na E3S a jeho deuterovaném interním standardu D4-E3S.
Seznam klíčové instrumentace:

• Hmotnostní spektrometr rapifleX (Bruker Daltonics)
• Software MALDI Pharma Pulse (MPP)
• Pipetovací platforma CyBio FeliX (Analytik Jena)
• 384-jamková MALDI destička a sušená kapka matrix Ph-CCA-NH2

Hlavní výsledky a diskuse

Ze 294 testovaných sloučenin bylo 67 potvrzeno jako inhibitory (≥50 % inhibice). Z nich 14 dosáhlo pIC50 ≥6, což svědčí o vysoké inhibiční potenci. Intraasay variability byla nízká (průměrný CV <10 %, SD ~0,3), což potvrzuje robustnost metody. Porovnání s fluorescenčními a radiolabelovými daty ukázalo shodu identifikovaných inhibitorů až do 83 %, čímž se potvrdila věrohodnost label-free MALDI-MS přístupu.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný vysokoprůchodový MALDI-MS protokol umožňuje:

• Label-free stanovení transportu léčiv v živých buňkách
• Rychlou identifikaci potenciálních DDI v modelu OATP2B1
• Snížení laborantní expozice a objemu radioaktivního či fluorescenčního odpadu
• Jednoduchou integraci do screeningových workflow farmaceutického výzkumu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření této technologie na další membránové transportéry a metabolyty. Kombinace s genomickými a proteomickými daty může vést k personalizované medicíně a predikci farmakokinetiky pacientů. Dále je možné využít pokročilou automatizaci a strojové učení pro rychlejší analýzu a predikci interakcí.

Závěr

Studie prokázala, že celý buněčný MALDI-TOF MS screening je spolehlivou, rychlou a citlivou metodou pro analýzu uptake a inhibice substrátů transportních proteinů. Představuje hodnotný nástroj pro farmaceutický výzkum a hodnocení lékových interakcí.

Reference

[1] Unger MS et al. Direct Automated MALDI Mass Spectrometry Analysis of Cellular Transporter Function: Inhibition of OATP2B1 Uptake by 294 Drugs. Analytical Chemistry. 2020;92:11851–11859.
[2] Beeman K et al. Integration of an In Situ MALDI-Based High-Throughput Screening Process: A Case Study with Receptor Tyrosine Kinase c-MET. SLAS Discovery. 2017;22:1203–1210.
[3] Simon RP et al. MALDI-TOF Mass Spectrometry-Based High-Throughput Screening for Inhibitors of the Cytosolic DNA Sensor cGAS. SLAS Discovery. 2019.
[4] Weigt D et al. Mechanistic MALDI-TOF Cell-Based Assay for the Discovery of Potent and Specific Fatty Acid Synthase Inhibitors. Cell Chemical Biology. 2019;26:1322–1331.
[5] Unger MS et al. Clinically Relevant OATP2B1 Inhibitors in Marketed Drug Space. Molecular Pharmaceutics. 2020.
[6] Karlgren M et al. Classification of inhibitors of hepatic organic anion transporting polypeptides (OATPs): influence of protein expression on drug-drug interactions. Journal of Medicinal Chemistry. 2012;55:4740–4763.