Imaging venom peptides and proteins at high mass resolution, high lateral resolution and high speed using the timsTOF fleX

Význam tématu

Studium prostorového rozložení peptidů a proteinů v žlázách jedových organismů je klíčové pro pochopení jejich biologické funkce, evoluce a potenciálního využití při vývoji terapeutik či agrochemických prostředků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat schopnosti instrumentu timsTOF fleX v oblasti MALDI-MSI analýzy jedových peptidů a menších proteinů vysoké hmotnosti (m/z 2000–8000) s vynikajícím rozlišením, přesností a rychlostí. Jako modelový systém sloužily žlázy stonožky Scolopendra morsitans.

Použitá metodika a instrumentace

Preparace vzorku:

• Fixace nožek („forcipules“) 50 % RCL2/ethanol, dehydratace, parafinová infiltrace.
• Řezání dohněda na 7 µm a deparafinace na ITO skle.
• Sublimace matrice DHB (50 µL acetonu s nasycením DHB + 100 µL acetonu) při 140 °C a 0,9 mbar.
• Rekrystalizace matrice pomocí Bruker ImagePrep (50 % methanol, 0,2 % TFA).

Instrumentace a akvizice:

• timsTOF fleX v QTOF módu, kalibrace Peptide Calibration Standard II (inzulín M + H+ 5730,61 Da).
• MALDI-MSI v pozitivním módu, m/z 800–10000, laterální rozlišení 20 µm, 2000 laserových výstřelů při 10 kHz, ~5 pixelů/s.

Softwarové zpracování:

• SCiLS Lab MVS: normalizace root mean squared, pLSA analýza (9 komponent).
• H&E barvení po akvizici pro histologickou korelaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Instrument prokázal:

• Vysoké hmotnostní rozlišení a přesnost (0–11 ppm) pro molekuly až ~6 kDa, včetně detailního rozlišení izotopických špiček.
• Široký dynamický rozsah – v datech bylo detekováno přes 4600 signálů, z nichž více než 1000 generovalo kvalitní zobrazovací data.
• Laterální rozlišení 20 µm a rychlost akvizice – umožňující mapování tisíců pixelů během několika minut.
• Prostorovou heterogenitu toxinů: odlišení více peptidů s rozdílnou abundancí a segregací v rámci žlázy.

Prostorová analýza s pLSA odhalila různé distribuční vzory toxinů, poukazující na kompartementalizaci produkce a uchovávání toxinů, jak bylo pozorováno i v jiných jedových žlázách.

Přínosy a praktické využití metody

• Detailní prostorové mapování jedových molekul přímo v tkáni bez nutnosti protilátek či sond.
• Možnost objevovat nové bioaktivní peptidy a proteiny pro vývoj léčiv a agrochemikálií.
• Integrace s proteomickými a genomickými workflow pro komplexní charakterizaci toxinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zapojení iontové mobility (TIMS) pro další zlepšení rozlišení komplexních směsí.
• Vývoj 3D IMS pro prostorově objemové zobrazení rozložení toxinů.
• Multi-omické přístupy spojující MSI s metabolomikou a transkriptomikou.
• Automatizace a využití AI pro pokročilou dekonvoluci a anotaci signálů.

Závěr

Studie demonstruje, že timsTOF fleX jako MALDI-MSI platforma poskytuje unikátní kombinaci vysoké hmotnostní resoluce, přesnosti, dynamického rozsahu a rychlosti, která otevírá nové možnosti pro prostorové studium jedových peptidů a menších proteinů. To umožňuje hlubší porozumění biologii toxinů a podporuje objevy v biomedicíně a průmyslu.

Reference

• Caprioli RM, Farmer TB, Gile J (1997). Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Analytical Chemistry, 69, 4751–4760.
• Undheim EAB, Hamilton BR, Kurniawan ND, Bowlay G, et al. (2015). Production and packaging of a biological arsenal: Evolution of centipede venoms under morphological constraint. PNAS, 112, 4026–4031.
• Undheim EAB, Sunagar K, Hamilton BR, Jones A, Venter DJ, Fry BG, King GF (2014). Multifunctional warheads: Diversification of the toxin arsenal of centipedes via novel multidomain transcripts. Journal of Proteomics, 102C, 1–10.
• Lewis J (1981). The Biology of Centipedes, Cambridge University Press.
• Hamilton BR, Marshall DL, Casewell NR, Harrison RA, et al. (2019). Mapping Enzyme Activity on Tissue by Functional Mass Spectrometry Imaging. Angew Chem Int Ed Engl, 59, 1–5.
• Madio B, Peigneur S, Chin YKY, Hamilton BR, et al. (2018). PHAB toxins: a unique family of predatory sea anemone toxins evolving via intra-gene concerted evolution defines a new peptide fold. Cellular and Molecular Life Sciences, 75, 4511–4524.
• Walker AA, Mayhew ML, Jin J, Herzig V, et al. (2018). The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens. Nat Commun, 9, 755.
• Dutertre S, Jin AH, Vetter I, Hamilton B, et al. (2014). Evolution of separate predation- and defence-evoked venoms in carnivorous cone snails. Nat Commun, 5, 3521.