MALDI-2 for enhanced in situ N-glycan analysis

Význam tématu

Analýza prostorové distribuce N-glykanů je klíčová pro pochopení jejich role v patologiích, jako jsou nádorová onemocnění, autoimunitní choroby i virové infekce. Konvenční metody MALDI-MS nabízejí vysokou propustnost, avšak často jsou omezeny na pozitivní ionizaci a poskytují pouze omezené strukturní informace. Zavedení laserem inducované postionizace MALDI-2 otevírá nové možnosti zvýšení citlivosti, zejména v negativním ionizačním módu, což usnadňuje spatiálně korelovanou analýzu N-glykanů přímo z tkáňových řezů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo zkombinovat MALDI-2 v negativním módu s přístrojem timsTOF fleX pro rozšíření citlivosti a zlepšení prostorové a strukturní analýzy N-glykanů v parafinem fixovaných řezích lidského mozečku. Autoři porovnali standardní pozitivní MALDI-MSI přístup s novou metodou (-)MALDI-2-MSI a ověřili možnost získat kvalitní MS/MS spektra přímo in situ.

Použitá metodika a instrumentace

Formalinem fixované a parafinem zalité (FFPE) řezy lidského mozečku o tloušťce 5 μm byly odparafinovány a rehydrátovány. Enzym PNGase F se nanesl automatizovaným robotem pro uvolnění N-glykanů. Matrice pro negativní ionizační mód byla nor-harmane, pro pozitivní 2,5-dihydroxyaceto­fenon; obě s interním standardem maltoheptaózy. Analýzy proběhly na timsTOF fleX MALDI-2 (Bruker Daltonics) za optimalizovaných podmínek: dusík, tlak 3,0 mbar; pulzní energie MALDI 34 μJ, MALDI-2 350 μJ; prodleva 30 μs; 50 laserových zásahů na pixel (negativní) a 500 zásahů (pozitivní).

Hlavní výsledky a diskuse

• Negativní módu MALDI-2 vedl k několikanásobnému zvýšení výtěžku [M–H]⁻ iontů oproti standardnímu negativnímu módu.
• Porovnání s pozitivní MALDI-MSI ukázalo obdobné prostorové distribuce N-glykanů v mozečku, s mírným posunutím relativní intenzity menších forem v negativním módu.
• In situ MS/MS analýza umožnila potvrdit strukturu 14 z 38 detekovaných N-glykanů přímo ze sekcí bez nutnosti extrakce.
• Korelace distribuce glykanů s expresí enzymu mannosidáza 1 alpha (man1a1) z Human Protein Atlas potvrdila převážnou lokalizaci v Purkyňových buňkách a granularní vrstvě.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost vysoce citlivé a prostorově rozlišené analýzy N-glykanů ve FFPE tkáních.
• Bez nutnosti oddělené extrakce a externí derivatizace pro potvrzení struktury.
• Vhodné pro glykomické studie v biomedicínském výzkumu a pro identifikaci potenciálních biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikace na širší spektrum glykokonjugátů a jejich izomerů za využití kombinace s iontovou mobilitou (TIMS) pro lepší separaci isomerů. Dále se předpokládá automatizace workflow pro rutinní nasazení v preklinickém a farmaceutickém výzkumu a integrace s multiomickými daty pro komplexní biologický kontext.

Závěr

MALDI-2 v negativním ionizačním módu významně zvyšuje citlivost a informační obsah analýzy N-glykanů přímo z tkáňových řezů. Díky vysoké kvality obrazové MS a možnosti in situ MS/MS potvrzení struktury představuje timsTOF fleX MALDI-2 kompletní a univerzální platformu pro moderní glykomiku.

Reference

1. Everest-Dass AV, Briggs MT, Kaur G, Oehler MK, Hoffmann P, Packer NH (2016). N-glycan MALDI imaging mass spectrometry on formalin-fixed paraffin-embedded tissues enables the delineation of ovarian cancer tissues. Mol Cell Proteomics. 15(9):3003−3016.
2. Scott DA et al. (2019). Increases in tumor N-glycan polylactosamines associated with advanced HER2-positive and triple-negative breast cancer tissues. Proteom Clin Appl. 13:1800014.
3. Briggs MT et al. (2019). MALDI mass spectrometry imaging of early- and late-stage serous ovarian cancer tissue reveals stage specific N-glycans. Proteomics. 19:1800482.
4. Drake RR et al. (2019). Defining the human kidney N-glycome in normal and cancer tissues using MALDI imaging mass spectrometry. J Mass Spectrom. 55:e4490.
5. Heijs B et al. (2020). Molecular signatures of tumor progression in myxoid liposarcoma identified by N-glycan mass spectrometry imaging. Lab Invest. doi:10.1038/s41374-020-0435-2.
6. Hall PL et al. (2018). Urine oligosaccharide screening by MALDI-TOF for the identification of NGLY1 deficiency. Mol Genet Metab. 124(1):82−86.
7. Reiding KR et al. (2018). High-throughput serum N-glycomics: method comparison and application to study rheumatoid arthritis and pregnancy-associated changes. Mol Cell Proteomics. 18(1):3−15.
8. Kotsias M et al. (2019). Improved and semi-automated reductive β-elimination workflow for higher throughput protein O-glycosylation analysis. PLoS ONE. 14(1):e0210759.
9. Jovanovic M, Peter-Katalinić J (2016). Negative ion MALDI-TOF MS, ISD, and PSD of neutral underivatized oligosaccharides without anionic dopant strategies, using 2,5-DHAP as a matrix. J Mass Spectrom. 51(2):111−122.
10. Huang C et al. (2019). Linkage and sequence analysis of neutral oligosaccharides by negative-ion MALDI tandem mass spectrometry with laser-induced dissociation. Anal Chim Acta. 1071:25−35.
11. Harvey DJ (2020). Negative ion mass spectrometry for the analysis of N-linked glycans. Mass Spectrom Rev. 00:1−94.
12. Powers TW et al. (2014). MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays. PLoS ONE. 9(9):e106255.
13. Powers TW et al. (2015). Two-dimensional N-glycan distribution mapping of hepatocellular carcinoma tissues by MALDI-imaging mass spectrometry. Biomolecules. 5(4):2554−2572.
14. Holst S et al. (2016). Linkage-specific in situ sialic acid derivatization for N-glycan mass spectrometry imaging from formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Anal Chem. 88(11):5904−5913.
15. Soltwisch J et al. (2015). Mass spectrometry imaging with laser-induced postionization. Science. 348:211−215.
16. Heijs B et al. (2020). MALDI-2 for the enhanced analysis of N-linked glycans by mass spectrometry imaging. Anal Chem. doi:10.1021/acs.analchem.0c02732.
17. Soltwisch J et al. (2020). MALDI-2 on a trapped ion mobility quadrupole time-of-flight instrument for rapid mass spectrometry imaging and ion mobility separation of complex lipid profiles. Anal Chem. 92:8697−8703.
18. Harvey DJ et al. (2012). MALDI-MS/MS with traveling wave ion mobility for the structural analysis of N-linked glycans. J Am Soc Mass Spectrom. 23(11):1955−1966.
19. Harvey DJ (2005). Fragmentation of negative ions from carbohydrates: part 2. Fragmentation of high-mannose N-linked glycans. J Am Soc Mass Spectrom. 16(5):631−646.