Re-discovering Bacterial Biofilm Heterogeneity with MALDI Imaging Mass Spectrometry

Význam tématu

Biofilmy představují komplexní mikrobiální společenství, která jsou klíčová v mnoha infekčních procesech u člověka. Heterogenita biofilmů na úrovni buněk a prostorových distribucí metabolitů, kovů a proteinů ovlivňuje jejich rezistenci vůči léčbě a adaptaci na hostitelské faktory, jako je nutriční imunita. Metoda MALDI zobrazovací hmotnostní spektrometrie (IMS) umožňuje vizualizaci těchto komponent při zachování prostorové informace, což je důležité pro detailní pochopení biofilmové architektury a dynamiky.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na charakterizaci prostorové heterogenity biofilmů Pseudomonas aeruginosa:

• porovnání biofilmů pěstovaných in vitro s biofilmy vyvíjejícími se v plicích pacientů s cystickou fibrózou
• určení vlivu hostitelského proteinu kalprotectinu, který chelatuje esenciální kovy, na prostorovou distribuci proteinů v biofilmu
• aplikace bottom-up proteomiky pro identifikaci odlišně distribuovaných proteinů v různých částech biofilmu

Použitá metodika a instrumentace

Bakteriální biofilmy byly pěstovány 5–6 dní v Drip Flow Biofilm reaktoru na skleněných podložních sklíčcích. Biofilm i lidské plicní řezy z pacientů s cystickou fibrózou byly kryosekcionovány (10–12 μm), opláchnuty etanolem a poté potaženy matricemi DHB a CHCA pomocí robotického aplikátoru HTX TM-Sprayer. IMS bylo prováděno na systému Bruker rapifleX TOF/TOF v lineárním pozitivním iontovém módu při 50 μm rozlišení a 50–500 laserových ran na pixel. Data byla analyzována v softwaru FlexImaging. Pro proteomiku byly mikrodisekce centrálních a okrajových oblastí biofilmu následovně lyzovány, proteiny extrahovány, kratičce separovány elektroforézou, in-gel štěpeny trypsinem a analyzovány na Thermo LTQ MS, výsledky vyhodnoceny pomocí Sequest a Scaffold.

Hlavní výsledky a diskuse

Histologické barvení prokázalo ko-kolonizaci P. aeruginosa a S. aureus v zánětlivých oblastech plicních řezu, kde IMS ukázalo lokalizaci specifických iontů proteinů a kalprotectinu. V in vitro biofilmech se významně lišila distribuce signálů m/z v centru a na okraji. Expozice kalprotectinu způsobila prostorově odlišné potlačení nebo akumulaci proteinových signálů, což indikuje kovově senzitivní subpopulace. Bottom-up proteomika potvrdila stovky rozdílně distribuovaných proteinů souvisejících s metabolizmem, stresem a synthézou proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

IMS umožňuje detailní mapování proteinové a kovové heterogenity biofilmů v jejich nativním prostředí bez destrukce vzorku. Tento přístup přináší nový pohled na mikrobiální struktury a jejich adaptace na hostitelskou imunitu. Klinicky lze tyto poznatky využít k vývoji cílených antimikrobiálních strategií a k lepší diagnostice polymikrobiálních infekcí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• zvyšování prostorového rozlišení IMS pro detekci drobných subpopulací
• integrování IMS s dalšími zobrazovacími modalitami (např. MRI, optická mikroskopie)
• multiomické přístupy spojující metabolomiku, proteomiku a lipidomiku
• aplikace in situ analýzy přímo na klinických vzorcích pro personalizovanou medicínu

Závěr

Studie demonstruje sílu MALDI IMS pro detailní analýzu biofilmové heterogenity, umožňuje identifikovat prostorové vzorce proteinů a kovů a odhalit vliv hostitelských faktorů, jako je kalprotectin. Díky kombinaci IMS a proteomiky bylo možné znovuobjevit komplexní architekturu biofilmů P. aeruginosa a poodhalit nové cíle pro intervence.

Reference

1. Brockhurst MA, Hochberg ME, Bell T, Buckling A. Character displacement promotes cooperation in bacterial biofilms. Curr Biol. 2006;16:2030–2034.
2. Sagel SD, et al. Impact of Pseudomonas and Staphylococcus infection on inflammation and clinical status in young children with cystic fibrosis. J Pediatr. 2009;154:183–188.
3. Wakeman CA, et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nat Commun. 2016;7:11951.