Analysis of Oligonucleotides by Capillary Gel Electrophoresis with the Agilent 7100 Capillary Electrophoresis System

Význam tématu

Capilární gelová elektroforéza (CGE) představuje spolehlivou metodu pro rozlišení oligonukleotidů podle velikosti. Je klíčová pro kontrolu kvality syntetizovaných primerů, monitorování modifikací nukleových kyselin a validaci biologických aplikací.

Cíle a přehled studie

Tato studie hodnotí vliv experimentálních parametrů na separaci čtyř oligonukleotidových standardů:

• porovnání tří typů gelů (PEG z různých zdrojů, s/bez acetonitrilu),
• využití dvou detekčních filtrů (260 nm, 280 nm) a test bez filtru,
• test tří neutrálně potažených kapilár (PVA, µSIL-WAX, µSIL DNA),
• optimalizace délky separace, teploty a napětí.

Použitá metodika a instrumentace

• Agilent 7100 Capillary Electrophoresis System s modulem OpenLab ChemStation.
• Kapiláry: PVA (100 µm), µSIL-WAX (100 µm), µSIL DNA (75 µm).
• Detekční rozhraní DAD s volitelnými 260 nm a 280 nm filtry.
• Elektrolyt: 200 mM BisTris, 200 mM kyselina boritá.
• Gely: 27 % PEG (různé šarže), 27 % PEG s 20 % acetonitrilem.
• Parametry: injekce elektrokinetická (–10 kV, 10 s), separace –25 až –30 kV, teplota 20–35 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekční filtry: 260 nm i 280 nm poskytují ostré špičky, 260 nm je výhodnější pro polyd(A).
• Gely: všechny testované PEG šarže byly vhodné; přidání 20 % acetonitrilu zlepšuje rozlišení u dlouhých oligonukleotidů.
• Kapiláry: PVA a µSIL-WAX vykazují lepší poměr signál/šum; PVA je snadnější na manipulaci.
• Reprodukovatelnost: RSD migrační doby posledního 21meru <1 % při 12 po sobě následujících vstupech.
• Délka separace: krátký konec (8,5 cm) urychluje analýzu s dostatečným rozlišením, dlouhý konec (24,5 cm) zvyšuje rozlišení.
• Teplota a napětí: nižší teplota zvýší rozlišení, vyšší napětí (30 kV) zkrátí dobu a zužuje špičky.
• Optimalizace pro pd(A) 40–60 mer: gel s 20 % acetonitrilem, 30 kV a 25 °C poskytuje nejlepší separaci.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda je vhodná pro kontrolu kvality primerů a syntetických oligonukleotidů:

• validace PCR primerů a sekvenačních aplikací,
• QC v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu,
• monitorování degradace a modifikací DNA/RNA.

Budoucí trendy a možnosti využití

• vývoj nových sítících matric pro vyšší rozlišení,
• automatizace a vysokopropustné CE systémy,
• spojení s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci sekvence,
• přechod na multikanálové systémy pro paralelní analýzu.

Závěr

Capilární gelová elektroforéza na platformě Agilent 7100 nabízí flexibilní nástroj pro rychlou a přesnou analýzu oligonukleotidů s možností snadné optimalizace separačních parametrů.

Reference

• Oligonucleotide Analysis with the Agilent Capillary Electrophoresis System. Agilent Technologies Application Note, 5988-4303EN, 2001.