Demonstrating a Fit-for-Purpose Solution for Biopharmaceutical Separations with the ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary System

Význam tématu

V biopharmaceutickém průmyslu je klíčové spolehlivě oddělit složité biologické vzorky, jako jsou glykany, konjugované protilátky nebo monoklonální protilátky. Pro zajímavé metody s pomalými průtoky a mělkými gradienty (např. peptide mapping) byly tradičně preferovány binární LC systémy pro přesné dávkování gradientu. Cílem je zajistit konzistentní výsledky napříč různými LC platformami a maximalizovat využití stávajícího vybavení laboratoře.

Cíle a přehled studie

Tato aplikace demonstruje, že systém ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary je vhodný pro běžné biopharmaceutické metody (HILIC, HIC, SEC) bez nutnosti úprav stávajících protokolů vytvořených pro kvaternární systémy. Systém byl testován z hlediska reprodukovatelnosti, robustness a kompatibility s vysokou koncentrací soli či nízkou disperzí.

Použitá metodika a instrumentace

Studie zahrnovala tři hlavní metodiky:

• HILIC separace uvolněných N-glykanů (RapiFluor-MS Glycan Standard) za využití amidosilikonové kolony a detekce FLR + QDa MS.
• HIC separace cystein-konjugovaného ADC v prostředí 1 M (NH₄)₂SO₄, sledování retenčních časů a distribuce DAR (drug-to-antibody ratio) v průběhu 25hodinových cyklů po dobu tří dnů.
• SEC analýza mAb Size Variant Standard pro rozlišení vysokomolekulárních (HMWS) a nízkomolekulárních (LMWS) fragmentů v izokratickém módu.

Hlavní instrumentace:

• ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary System s čerpadlem CH-A
• FLR detektor (λEx 265 nm, λEm 425 nm) a ACQUITY QDa Detector
• Protein-Pak Hi Res HIC Column (2,5 µm, 4,6 × 100 mm)
• BioResolve SEC mAb Column (2,5 µm, 4,6 × 150 mm)
• Empower 3 Chromatography Data Software FR4

Hlavní výsledky a diskuse

HILIC: Porovnání 19 glykanů mezi binárním a kvaternárním systémem ukázalo velmi podobné chromatogramy, průměrný rozdíl v GU < 0,1 (cca 3,5 s) a korelační koeficient R² = 0,99996. Relativní plocha všech špiček se lišila o méně než 0,06 % (výjimka 0,6 % pro vysoce zastoupený glykan).

HIC: Test stability při vysoké koncentraci solí (1 M (NH₄)₂SO₄) proběhl ve třech po sobě jdoucích dnech (celkem 30 cyklů). Standardní odchylka retenčních časů byla < 1 s pro deset identifikovaných špiček a průtokový tlak zůstal stabilní (Δpressure ~ 50 psi), bez známek srážení soli nebo ucpání.

SEC: Díky nízkodisperznímu systému a moderní SEC kolóně bylo dosaženo jasného oddělení HMWS od monomeru a rozlišení LMWS 1&2, které u tradičních metod často splývají. Reprodukovatelnost retenčních časů i plošných poměrů byla vysoká.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost přímé migrace metod mezi kvaternárními a binárními systémy bez úprav protokolů.
• Robustní provoz za vysokého obsahu solí pro nondenaturující separace.
• Zvýšení šíře aplikací jediné LC platformy v QC laboratoři.
• Lepší rozlišení nízkomolekulárních a vysokomolekulárních druhů v SEC metodách.

Budoucí trendy a možnosti využití

S rostoucí poptávkou po multifunkčních LC systémech lze binární technologie kombinovat s moderními kolónami a senzory (MS detekce, výměnné fluoře stanice) pro vyšší flexibilitu a automatizaci. Dále se očekává rozšíření využití pokročilé softwarové integrace dat pro rychlejší rozhodování v developmentu i QC.

Závěr

ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary System je plně fit-for-purpose pro biopharmaceutické separace HILIC, HIC a SEC. Umožňuje přenos stávajících metod bez kompromisů v kvalitě dat, zlepšuje provozní robustnost a přináší lepší rozlišení složitých vzorků.

Reference

1. Dao D., Koshel B.M., Birdsall R.E. Demonstrating Method Equivalency… Waters Application Note, 720007147EN, 2021.
2. Dao D., Koshel B.M., Birdsall R.E. Repeatability of the ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary System… 720007086EN, 2020.
3. Waters Care and Use Manual RapiFluor-MS Glycan Performance Test Standard, 720005349EN, 2015.