ŘEŠENÍ STRUKTUR CYKLOSPORINU METODOU HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

Význam tématu

Hmotnostní spektrometrie (MS) představuje klíčovou metodu v organické chemii pro stanovení molekulové hmotnosti, elementárního složení a struktury složitých přírodních i syntetických peptidů. Cyklosporiny, významné imunosupresivní a antifungální undekapeptidy, vyžadují přesnou analýzu pro výzkum, klinickou praxi i vývoj nových derivátů.

Cíle a přehled studie

Práce se zaměřuje na rozvoj metodických postupů MS pro detailní charakterizaci cyklosporinů a jejich směsí. Hlavním cílem je demonstrovat využití různých ionizačních technik a tandemové MS při určování molekulové hmotnosti, sekvencí aminokyselin, rozdílného chování izobarických zbytků a analýze komplexních reakcí.

Použitá metodika a instrumentace

Analýzy byly provedeny pomocí následujících technik:

• FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB) a FAST ION BOMBARDMENT (FIB) pro měkkou ionizaci undekapeptidů
• TANDEMOVÁ hmotnostní spektrometrie (MS/MS) se dvěma spřaženými analyzátory pro kolizní fragmentaci
• HOŘEČNÉ sektorové přístroje s vysokým rozlišením (peak-matching) pro přesné měření elementárního složení
• HPLC spojená s ESI i APCI ionizací pro separaci a průběžnou kolizní fragmentaci eluovaných peptidů
• MALDI-TOF a CF-FAB pro kvantitativní stanovení a rychlou analýzu metabolitů

Hlavní výsledky a diskuse

MS spektra FAB prokázala molekulové ionty [M+H]+ a [M+Na]+ cyklosporinu A (m/z 1202,8/1224,8). Nízkohmotnostní oblast odhalila charakteristické imonní ionty aminokyselin (např. N-methyl-leucin m/z 100,1). MS/MS umožnila sekvenční analýzu lineárních fragmentů tubo-undekapeptidů, odhalení míst primárního otevírání kruhu a potvrzení pozice N-methyl-aminokyselin. Izobarické zbytky (Leu vs. Ile, Ala vs. Sar) byly rozlišeny pomocí deuterované matice a sledování hmotnostních posunů fragmentů. Metody HPLC-ESI/APCI-MS ukázaly selektivní detekci minoritních cyklosporinů a metabolitů v biologických vzorcích.

Přínosy a praktické využití metody

Moderní MS poskytuje vysokou citlivost (detekce femtomolů), rychlou analýzu a možnost kvantitativního stanovení cyklosporinů v biologických matricích. Tandemová MS výrazně zjednodušuje sekvenční analýzu cyklických peptidů, zatímco HPLC-MS usnadňuje profiling směsí a monitorování biotransformací.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se očekává v miniaturizaci a automatizaci ionizačních zdrojů (nano-ESI), vylepšení rozlišení a rychlosti TOF analyzátorů, v integraci MS imaging pro prostorovou analýzu vzorků a ve využití vysokotlaké mikrofluidiky pro separaci peptidů v reálném čase. Rozšiřuje se aplikace v metabolomice a v klinickém monitoringu imunosuprese.

Závěr

Synergické použití měkkých ionizačních technik, vysokorozlišovacího a tandemového MS spolu s chromatografickými separacemi nabírá na významu při strukturní analýze cyklosporinů. Metody přinášejí rychlé, citlivé a selektivní analýzy, které podporují výzkum, klinickou praxi i vývoj nových terapeutických derivátů.

Reference

1. Wenger R.M.: Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 50, 123 (1986)
2. Twentyman P.R.: Br. J. Cancer. 57, 254 (1988)
3. Rosenwirth B. et al.: Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1763 (1994)
4. Henricsson S. et al.: Transplant. Proc. 27, 837 (1989)
5. Kalinoski H.T. et al.: Biomed. Environ. Mass Spectrom. 15, 239 (1988)
6. Cotter R.J., Tabet J.-C.: Int. J. Mass Spectrom. Ion Phys. 53, 151 (1983)
7. Traber R. et al.: Helv. Chim. Acta 70, 13 (1987)
8. Orlando R. et al.: Org. Mass Spectrom. 24, 1033 (1989)
9. de Pauw E.: Mass Spectrom. Rev. 5, 191 (1986)
10. Roepstorff P., Fohlman J.: Biomed. Mass Spectrom. 11, 601 (1984)
11. Hartman N.R. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 133, 964 (1985)
12. Biemann K., Scoble H.A.: Science 237, 992 (1987)
13. Havlíček V. et al.: Org. Mass Spectrom. 28, 1440 (1993)
14. Sedmera P. et al.: Tetrahedron Lett. 36, 6953 (1995)
15. Havlíček V.: Disertační práce, VŠCHT Praha (1995)
16. Havlíček V. et al.: J. Mass Spectrom. 30, 940 (1995)
17. Cordero M.M. et al.: Anal. Chem. 65, 1594 (1993)
18. Havlíček V. et al.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, S158 (1995)
19. Jegorov A. et al.: Amino Acids 10, 145 (1996)
20. Muddiman D.C. et al.: Anal. Chem. 66, 2362 (1994)