Visualization of Phospholipids and Glucose in Rice Koji Using Microscopic Mass Spectrometry Imaging

Význam tématu

Rice koji dodává enzymy rozkládající škrob a proteiny, zásadně ovlivňuje senzorické vlastnosti sake. Dosavadní hodnocení kvality se spoléhá na zkušenost sladovnických mistrů, chybí objektivní molekulární a strukturální analýza. Aplikace mikroskopické zobrazovací hmotnostní spektrometrie (MSI) umožňuje zobrazit prostorové rozložení klíčových metabolitů a struktury vzorků v různých fázích přípravy.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout workflow MSI pro vizualizaci distribuce fosfolipidů a glukózy v surovém rýžovém zrnu, po napaření a v rice koji. V další části studie byla zavedena kombinace MSI s GUS reportérem pro sledování procesu infiltrace mycelia (hazekomi) a jeho korelace s produkcí glukózy.

Použitá metodika

• Vzorky: surová rýže, napařená rýže a rice koji z Yamada Nishiki (70 %) a Hakutsuru Nishiki (70 %).
• Příprava řezů: embedding v 4 % karboxymethylcelulóze, zmrazení na –80 °C, řezy 20 μm na kryomikrotomu, upevnění na ITO sklo pomocí lepicí folie.
• Matrixy: CHCA (vapor-depozice a nanášení sprejem; ACN / IPA / H2O 3 : 1 : 6 s 0,1 % HCOOH), NEDC (vapor-depozice a rekryštalizace methanolem) pro glukózu.
• Podmínky MSI: Shimadzu iMScope (laser 100 zásahů, 45 % intenzita, detektor 2,1 kV); pozitivní režim m/z 400–800, rozlišení 25 μm pro fosfolipidy; negativní režim m/z 180–230, rozlišení 50 μm pro glukózu.
• Analýza dat: Imaging MS Solution a IMAGEREVEAL MS (statistická analýza, korekce obrazu, extrakce podobných obrazů).

Použitá instrumentace

• Kryomikrotom, kryofilm, ITO skleněné podložky
• iMLayer™ systém pro matrix vapor-depozici
• Shimadzu iMScope QT/TRIO
• Termostatická komora, standardní laboratorní vybavení

Hlavní výsledky a diskuse

Vizualizace cholinu odhalila akumulaci v klíčku surové rýže, pokles po napaření a následný nárůst v jádru koji. Distribuce lysophosphatidylcholinů LPC(16:0) a LPC(18:2) a dalších fosfolipidů byla heterogenní, odpovídala invazi mycelia (hazekomi). GUS reportér umožnil sledovat postup hazekomi v čase (24, 31, 43 h), přičemž MSI ukázala postupný nárůst glukózy ([M+Cl]– m/z 215,02) od povrchu k nitru zrnek. Zjištěna byla prostorová variabilita produkce glukózy v závislosti na lokalizaci hyf.

Přínosy a praktické využití metody

Objektivní sledování kvality rice koji, standardizace výrobního procesu, optimalizace tvorby enzymů a metabolitů, podpora rozhodování v průmyslové výrobě sake a dalších fermentovaných produktů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření MSI na další skupiny metabolitů (aminokyseliny, cukerné alkohol), aplikace na různé odrůdy a produkty založené na koji, integrace s netargetovanou statistickou analýzou a vyšší rozlišení pomocí nových modelů iMScope QT.

Závěr

Studie představila nové workflow MSI v kombinaci s GUS reportérem pro komplexní vizualizaci struktury, infiltrace mycelia a distribuce glukózy v rice koji. Tento přístup otevírá cestu k vědecky podložené kontrole kvality a optimalizaci fermentačních procesů.

Reference

• 1. Shimma S. a kol. Shimadzu Application Note No.57.
• 2. Shimma S. a Sagawa T. Shimadzu Application Note No.63.
• 3. Shimma S. et al., J. Mass Spectrom. 2013, 48, 1285.
• 4. Zaima N. et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2010, 24, 2723.
• 5. Wisman A.P. et al., J. Biosci. Bioeng. 2020, 129, 296.
• 6. Wisman A.P. et al., J. of Brew. Soc. Japan, in press.
• 7. Yoshii M. a Aramaki I., J. of Brew. Soc. Japan 2001, 96, 806.
• 8. Wang J. et al., Anal. Chem. 2015, 87, 422.