LCMS Bioanalysis of Antibody Drugs Using Fab-Selective Proteolysis nSMOL - Trastuzumab analysis

Význam tématu

Monoklonální protilátky se staly klíčovými biologickými léčivy pro léčbu onkologických i imunitních onemocnění. Tradiční ELISA metody vykazují omezení v důsledku křížové reaktivity a interferencí matrice. nSMOL technologie umožňuje selektivní proteolýzu Fab regionu, čímž se výrazně redukuje šum pozadí a zvyšuje spolehlivost kvantitativní analýzy v komplexních biologických matricích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit aplikovatelnost nSMOL Antibody BA kitu pro kvantifikaci trastuzumabu v lidské plazmě a prokázat splnění kritérií „Guideline on Bioanalytical Method Validation in Pharmaceutical Development“ japonského ministerstva zdravotnictví. Testovaná metoda byla validována od preklinické po klinickou fázi pro kontinuální použití jediné analýzy.

Použitá metodika

Protokol zahrnoval tyto kroky:

• Selektivní proteolýza Fab regionu protilátky pomocí trypsinu navázaného na pryskyřici (nSMOL)
• Odstranění nespecifických proteinů a čistění vzniklých peptidů
• LC-MS/MS analýza signaturních (CDR-obsahujících) peptidů
• MRM kvantifikační přechody pro peptidy P14R a IYPTNGYTR
• Kvantifikační rozsah v plazmě 0,061–250 μg/ml s průměrnou přesností 100,7 %

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Nexera X2
• Kolona Shim-pack GISS C18 (50 mm × 2,1 mm) při 50 °C
• Mobilní fáze: A – 0,1 % formová kyselina/voda, B – 0,1 % formová kyselina/acetonitril, gradientní program od 1 % do 95 % B
• Flow rate 0,4 ml/min, objem injekce 10 μl
• MS detektor LCMS-8050/8060 s ESI pozitivní ionizací
• Teploty: DL 250 °C, Heat Block 400 °C, Interface 300 °C
• Plyny: nebulizér 3 l/min, sušící a vyhřívací plyn 10 l/min

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla dolní meze kvantifikace (LLOQ) 0,06 μg/ml s CV pod 10 % a přesností v rozmezí 88–106 %. Validace potvrdila stabilitu vzorků při zmrazení/rozmrazení i dlouhodobou stabilitu až 48 h po přípravě. Selektivní Fab proteolýza minimalizovala interferenci matrice a umožnila krátký čas analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

nSMOL BA Kit nabízí univerzální a reprodukovatelné řešení pro bioanalýzu monoklonálních protilátek. Metoda je flexibilní pro různé protilátky bez nutnosti zásadních úprav protokolu a je vhodná pro preklinické i klinické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření nSMOL na multiplexní analýzu více protilátek současně, integrace s automatizovanými platformami vzorkové přípravy a aplikace pro nové biologické formy včetně konjugovaných protilátek.

Závěr

nSMOL technologie představuje robustní, validovanou a univerzální metodu pro kvantitativní analýzu monoklonálních protilátek v komplexních matricích. Splňuje přísné validační standardy a posouvá hranice bioanalytické praxe díky snížené interferenci matrice a efektivní přípravě vzorku.

Reference

1. Iwamoto N et al. Analyst, 2014, DOI:10.1039/c3an02104a
2. Iwamoto N et al. Anal Methods, 2015, DOI:10.1039/c5ay01588j