Development of an automated MHC-associated peptide enrichment method for immunopeptidomics analysis using AssayMAP large capacity cartridges

Význam tématu

Imunopeptidomika se zaměřuje na analýzu peptidů navázaných na hlavní histokompatibilitní komplex MHC. Tyto peptidy jsou v buňkách v nízké koncentraci a vyžadují citlivé a reprodukovatelné metody obohacení. Automatizace tohoto procesu je klíčová pro pokročilý výzkum imunologie, vývoj vakcín a diagnostiku.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl vyvinout vysoce propustný a opakovatelný automatizovaný pracovní postup pro obohacení MHC I peptidů s použitím kazet AssayMAP a následnou analýzu na nanoflow LC MS systému Agilent 1290 Infinity II s 6550 iFunnel Q TOF.

Použitá metodika a instrumentace

• Imunopurifikace na platformě AssayMAP Bravo s kazetami PAW 25 µL. Monoklonální protilátka w6/32 byla křížově vázána na protein A pomocí dimethyl pimelimidatu.


• Lyze buněk GRANTA 519 v nedenzeračním pufru a imunoprecipitace MHC I komplexů na kazetách.


• Separace a desalting peptidů na C18 kazetách 5 µL.


• Analýza nanoLC MS na Agilent 1290 Infinity II s Nanodaptérem a 6550 iFunnel Q TOF. Gradient 90 minut, data dependent acquisition. Vyhodnocení dat v Byonic a kvantifikace v Byologic.

Hlavní výsledky a diskuse

• Ve třech nezávislých bězích bylo identifikováno 2282 až 2424 unikátních MHC I peptidů, celkem 3604 s průměrným CV 3 procenta.


• Kvantifikace abundancí vykázala CV cca 11 procent, což potvrzuje vysokou reprodukovatelnost automatizovaného workflow.


• Distribuce délek peptidů ukázala, že 94 procent má délku 8 až 11 aminokyselin a 75 procent tvoří 9-mery.


• Při analýze 9-merů byl detekován charakteristický motív s preferencí L nebo V na C terminálním místě a specifickou preferencí na pozici 2.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný postup zkracuje čas přípravy vzorku, snižuje variabilitu a umožňuje vysokou propustnost. Metoda je vhodná pro výzkum prezentace peptidů na MHC, identifikaci imunogenních epitopů a screening kandidátů pro vakcinační strategie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Implementace vyšších rezolucí hmotových spektrometrů pro hlubší pokrytí peptidomu.


• Využití izotopových standardů a multiplexních značkovačů pro absolutní kvantifikaci.


• Rozšíření na MHC II asociované peptidy a neoantigeny v onkologii.


• Plná automatizace procesu od přípravy vzorku po analýzu dat v kombinaci s umělou inteligencí.

Závěr

Vyvinutý automatizovaný workflow s využitím kazet AssayMAP a nanoflow LC MS analýzy poskytuje robustní a reprodukovatelné řešení pro imunopeptidomiku. Metoda umožňuje spolehlivou identifikaci a kvantifikaci MHC I peptidů s nízkou variabilitou.

Reference

• Pollock S Wu S Han J Murphy S Development of an automated MHC associated peptide enrichment method for immunopeptidomics analysis using AssayMAP large capacity cartridges ASMS 2020 ThP 412