New Capabilities for Monitoring Released N-Glycans through the Combined Use of RapiFluor-MS Labeling, ACQUITY UPLC H-Class Bio System, and Serial Fluorescence/ACQUITY QDa Mass Detection

Význam tématu

Glykanová profilace u bioterapeutik je nezbytná pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a stability produktů. Detailní charakterizace uvolněných N-glykanů pomáhá sledovat kritické kvalitativní parametry výroby a umožňuje rychlou detekci změn glycosylačního vzorce.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované studie bylo vyvinout rychlý a praktický pracovní postup pro monitoring uvolněných N-glykanů z IgG kombinací Rapi Fluor-MS značení, UPLC separace a sekvenční detekce fluorescencí a hmotnostní spektrometrií pomocí ACQUITY QDa. Studie demonstruje zkrácení doby přípravy vzorku na 30 minut a získání kvantitativních a kvalitativních dat v jednom běhu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky glykanového standardu a uvolněné N-glykany z IgG byly označeny reagentem Rapi Fluor-MS a separovány na ACQUITY UPLC H-Class Bio System s kolónou Glycan BEH Amide (2.1×150 mm, 1.7 µm, 130 Å). Eluce probíhala gradientem acetonitril–ammonium formiátu pH 4.4 při 60 °C. Detekce byla vedena paralelně fluorescenčním detektorem (Ex 265 nm, Em 425 nm) a sériovým hmotnostním detektorem ACQUITY QDa (ESI+, 500–1250 Da, 15 V cone, 1.5 kV capillary, 500 °C). Analýzy byly řízeny softwarem Empower 3 CDS.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání s tradičním 2-AB značením odhalilo až stonásobné zvýšení citlivosti MS a posun nabíjení u složitějších glykanů směrem k vyšším nabitým stavům ([M+2H]2+, [M+3H]3+), které spadají do rozsahu ACQUITY QDa. Kombinovaná FLR/MS detekce poskytla vysokoúrovňové chromatografické a hmotnostní spektra pro všechny hlavní glykanové formy v rámci jediného běhu, včetně detailního osamostatnění izobarických izomerů FA2G1a/FA2G1b.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlou přípravu vzorků (<30 min) bez komplikovaných kroků.
• Vysokou citlivost FLR i MS detekce pro nízké množství glykanů.
• Jednoduchou obsluhu ACQUITY QDa bez nutnosti expertního znalce MS.
• Komplexní data o kvantitě, čistotě a hmotnosti glykanových špiček.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření této platformy na další glykoproteiny včetně monoklonálních protilátek a vakcín. Integrace s plně automatizovanými pracovními postupy může dále zkrátit čas analýzy a zvýšit reprodukovatelnost. Vývoj pokročilých MS detektorů a algoritmů pro stereochemickou charakterizaci glykanů otevře nové možnosti pro hloubkovou analýzu glycome.

Závěr

Kombinace Rapi Fluor-MS značení a UPLC-FLR-MS s ACQUITY QDa představuje robustní řešení pro rutinní monitoring N-glykanů. Metoda výrazně zkracuje dobu přípravy, zvyšuje citlivost a přináší jednoznačná hmotnostní data pro potvrzení glykanových profilů, aniž by bylo potřeba expertní MS znalosti.

Reference

1. Lauber M. A. et al. Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Novel Fluorescence and MS-Active Labeling Reagent. Waters Application Note 720005275EN, 2015.