Characterization of Biotherapeutics: ACQUITY UPLC H-Class Bio with 2D Part 3 of 3: On-line Enrichment of Low Abundance Species

Význam tématu

Charakterizace bioterapeutik, zejména monoklonálních protilátek, klade vysoké nároky na přesnou separaci a identifikaci různých variant proteinů. Nízká volatilita pufrů a přítomnost solí v iontově-výměnných separacích brání přímému napojení na hmotnostní spektrometrii. On-line obohacení nízkoodborných frakcí prostřednictvím dvoudimenzionální UPLC umožňuje automatizovanou frakcionaci, desalting a kvantifikaci bez ztrát vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem třetí části seriálu bylo demonstrovat schopnost systému ACQUITY UPLC H-Class Bio s 2D Technology automaticky obohacovat nízkoodborné varianty bioterapeutik. Testovací maticí byla monoklonální protilátka infliximab. Studie se zaměřila na on-line „heart-cut“ techniku, opakované sběry frakcí a následnou peptidovou analýzu k identifikaci modifikací zodpovědných za změny náboje.

Použitá metodika a instrumentace

• LC systém: ACQUITY UPLC H-Class Bio se dvěma pumpami (Quaternary a Binary Solvent Manager) a dvěma nezávislými ventily pro heart-cut.
• Detektory: UPLC TUV (280 nm) v 1. dimenzi, UPLC PDA v 2. dimenzi.
• Kolony: 1. dimenze – Protein-Pak Hi Res SP SCX (4,6×100 mm, 7 µm); C4 RPLC (2,1×50 mm, 1,7 µm); 2. dimenze – Peptide BEH C18 (2,1×100 mm, 1,7 µm).
• MS: Xevo G2-S QTof, kapilára 3 kV, konus 80 V, zdroj 120 °C, desolvace 300 °C, 800 L/h.
• Software: MassLynx 4.1 pro sběr dat, UNIFI 1.7 pro peptidovou mapu.
• Příprava vzorku: Deglykozylace PNGaseF, ošetření karboxypeptidázou B, trypsinové štěpení.

Hlavní výsledky a diskuse

Heart-cut provedený mezi 6,40 a 6,90 minutami izoloval kyselé varianty protilátky. Opakovaným sběrem až pěti frakcí bylo dosaženo lineárního nárůstu navrácené hmotnosti (od ~1 µg do ~5 µg), přičemž récupérerace byla zachována na vysoké úrovni. Peptidová analýza obohacených frakcí odhalila deamidaci asparaginu ve fragmentu T7, lokalizovanou pomocí MSE fragmentace, která potvrdila přítomnost isoasparaginu a asparaginu ve stechiometrickém poměru ~3:1 a charakteristický posun hmotnosti o 1 Da.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizovaná on-line frakcionace a desalting s minimální manipulací se vzorkem.
• Možnost obohacení nízkoodborných variant v jednom experimentu bez manuálního sběru zkumavek.
• Přímá kvantifikace z optického detektoru zvyšuje návratnost vzorku.
• Integrované připojení na MS a peptidovou mapu v UNIFI zrychluje charakterizaci modifikací.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody na další typy proteinových léků a konjugátů, integrace s vysoce výkonnou proteomikou a adaptace na průmyslové QA/QC procesy. Dále je možné kombinovat s dalšími detekčními moduly (např. intact mass) pro komplexní charakterizaci.

Závěr

Systém ACQUITY UPLC H-Class Bio s 2D Technology prokázal vysokou efektivitu a reprodukovatelnost při frakcionaci, on-line obohacení a následné analýze nízkoodborných variant bioterapeutik. Automatizace procesu šetří čas i vzorek a přináší detailní informace o modifikacích proteinu.

Reference

1. Liu J., et al. Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies. mAbs. 2012;4(5):578–585.
2. Cheng C., et al. C-terminal lysine variants in fully human monoclonal antibodies: Investigation of test methods and possible causes. Biotechnology and Bioengineering. 2008;100(6):1132–1143.
3. Brorson J., Jia A. Therapeutic monoclonal antibodies and consistent ends: terminal heterogeneity, detection, and impact on quality. Current Opinion in Biotechnology. 2014;30:140–146.
4. Annesley T. Ion Suppression in Mass Spectrometry: Clinical Chemistry. 2003;49(7):1041–1044.
5. Fersht A. Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding. 3rd ed. W.H. Freeman; 2000. p.103–131.
6. Geiger T., Clarke S. Deamidation, Isomerization, and Racemization at Asparaginyl and Aspartyl Residues in Peptides. Journal of Biological Chemistry. 1987;262(2):785–794.