Protein A Affinity Capture followed by AdvanceBio SEC Aggregation Analysis using the Agilent Infinity Series 2D-LC System

Význam tématu

Proteinové bioterapeutika, zejména monoklonální protilátky, představují klíčové léčebné modality v boji proti závažným onemocněním. Vysoká komplexita těchto makromolekul vyžaduje citlivé a robustní analytické nástroje pro kontrolu čistoty, stanovení titru a detekci agregátů. Kombinace afinitního zachycení na Protein A a velikostně vylučovací chromatografie (SEC) v jednom analytickém běhu přináší významné zrychlení a zjednodušení procesu kvality (QC) v biotechnologickém i farmaceutickém průmyslu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat využití systému Agilent Infinity Series 2D-LC pro jednorázové stanovení titru a agregace monoklonálních protilátek. Metodika propojuje první dimenzi afinitní zachycení na Protein A s druhou dimenzí SEC bez potřeby frakční kolekce. Studie porovnala separace standardní IgG a heat‐stresované IgG za účelem ověření citlivosti a rozlišení agregovaných forem.

Použitá metodika a instrumentace

Analytická 2D-LC sestava:

• První dimenze: Agilent 1260 BioLC s Biomonolith Protein A kolonkou (5069-3639), pufr 100 mM PBS, eluce 500 mM octové kyseliny, průtok 0,75 mL/min.
• Ventilový modul: Agilent 2DLC quick‐change multiple heart‐cutting ventil s dvanácti 40 µL smyčkami.
• Druhá dimenze: Agilent 1290 binary pump s AdvanceBio SEC 300 Å, 2,7 µm (PL1580-3301), izokraticky 10 mM PBS pH 7,4, průtok 0,35 mL/min, teplota 25 °C, detekce DAD.
• Software: Agilent OpenLab s 2DLC add-on pro konfiguraci metod a sběr dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Protokol umožnil zkrácení doby analýzy díky bezprostřednímu přepojení afinitní a velikostní dimenze. Typická chromatografie Protein A zachytila a čistě eluovala IgG, následovala separace na SEC s jasným rozlišením monomeru, dimeru a vyšších agregátů. Heat‐stresovaná IgG vykázala zvýšený podíl agregovaných forem, což studie demonstrovala překrytím chromatogramů. Eliminace frakční kolekce snížila riziko ztráty vzorku i kontaminace.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednorázová injekce kombinuje stanovení titru a agregace pro urychlenou kontrolu kvality mAb.
• Vyšší čistota analýzy díky afinitnímu předčištění Protein A.
• Snížení času a práce s minimálním rizikem manipulace se vzorky.
• Jednoduchá integrace do stávajících QC laboratoří bez nutnosti samostatných přístrojů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikací 2D-LC k vysoce propustné analýze panelů protilátek, případně s modifikovanou afinitní fází pro různé izotypy. Další vývoj by mohl zahrnovat integraci hmotnostní spektrometrie pro peptidovou mapu či detekci PTM, micro-flow režimy pro snížení spotřeby pufrů či automatizované workflow řízené umělou inteligencí pro pokročilou interpretaci dat.

Závěr

Systém Agilent Infinity Series 2D-LC efektivně propojuje Protein A afinitu a SEC v jediném běhu, čímž nabízí rychlou a citlivou metodu pro stanovení titru i agregace monoklonálních protilátek. Tento přístup zjednodušuje proces QC, zkracuje dobu analýzy a zvyšuje kvalitu výsledků.

Reference

1. Agilent Technologies Application Note 5991-2880EN (2013): Analysis of Monoclonal Antibody Digests with the Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution.
2. Agilent Technologies Application Note 5989-9733EN (2008): Rapid Human Polyclonal IgG Quantification Using the Agilent Bio-Monolith Protein A HPLC Column.
3. Agilent Technologies Application Note 5991-2990EN (2014): Agilent Bio-Monolith Protein A Monitors Monoclonal Antibody Titer from Cell Cultures.