Reducing Cycle Time for Quantification of Human IgG Using the Agilent Bio-Monolith Protein A HPLC Column

Význam tématu

Protein A je běžně využívaný pro analýzu a purifikaci protilátek díky své vysoké afinitě k Fc fragmentům IgG. V praxi je přesná a rychlá kvantifikace IgG nezbytná pro vývoj bioterapeutik, monitorování procesů výroby i kontrolu kvality.

Cíle a přehled studie

• Zkrátit dobu analýzy lidského IgG o přibližně 20 % pomocí střídavé regenerace kolon.
• Prokázat, že bio-inertní systém bez kovových částí udrží vysokou reprodukovatelnost měření.
• Představit kombinaci Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC a 1290 Infinity Flexible Cube pro efektivní střídání kolon.

Použitá metodika a instrumentace

Pro stanovení IgG byla použita následující aparatura a podmínky:

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary pumpa, autosampler s chlazením, vyhřívaná kolónová komora a DAD detektor (280 nm).
• Agilent 1290 Infinity Flexible Cube s bio-inertním pístovým čerpadlem (nízký tlak, až 60 bar), Quick-Change 2-position/10-port ventil a solvent selection ventil.
• Dvě Agilent Bio-Monolith Protein A HPLC kolony (p/n 5069-3639) ve střídavém režimu: jedna kolona pro analýzu, druhá pro regeneraci.
• Chromatografické podmínky: Buffer A = PBS pH 7.4, Buffer B = 0.5 M kyselina octová pH 2.6; gradient: 0–0.5 min 0 % B, 0.51–1.50 min 100 % B, návrat k 0 % B a zvýšení průtoku na 1.5 mL/min pro vypláchnutí zbytku kyseliny.
• Injekční objem 3 µL, teplota autosampleru 4 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Implementací dvou kolon ve 1290 Flexible Cube a jejich střídavým napájením a regenerací bylo dosaženo:

• Úspora 0.5 min na cyklus, tedy ~20 % zkrácení doby analýzy (u 500 vzorků úspora >4 h).
• Výborná intra-kolónová přesnost (RSD RT <0.495 %, RSD plochy <2.15 %) a inter-kolónová reprodukovatelnost (RSD RT <0.481 %, RSD plochy <2.21 %).
• Stabilní chromatogramy při 20 po sobě následujících bězích ukazují konzistentní navazení a separaci IgG.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená propustnost laboratoří díky zkráceným cyklům.
• Nižší provozní náklady díky využití jednoho pístového čerpadla pro regeneraci bez potřeby druhé drahé pumpy.
• Vysoká reproducibilita měření díky bio-inertnímu toku bez kovových komponent.
• Snadná integrace do stávajících Agilent HPLC systémů a softwaru.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na kvantifikaci dalších protilátek, biosimilar a Fc-fúzních proteinů.
• Automatizace a integrace s robotickými vzorkovači pro vysokokapacitní screening.
• Využití dalších bio-monolitických kolon pro analýzu rozličných biomolekul.
• Online monitoring stavu kolony a prediktivní údržba pomocí pokročilých softwarových nástrojů.

Závěr

Popsaná metoda střídavé regenerace Bio-Monolith Protein A kolon na Agilent 1260/1290 systémech přináší významné časové úspory při zachování vysoké přesnosti a reprodukovatelnosti. Díky bio-inertnímu toku je minimalizována koroze a znečištění, což zajišťuje spolehlivou kvantifikaci IgG v bioterapeutických a QA/QC aplikacích.

Reference

1. Rapid Human Polyclonal IgG Quantification Using the Agilent Bio-Monolith Protein A HPLC Column, Agilent Technologies Application Note 5989-9733EN, 2008
2. Agilent Bio-Monolith Protein A Monitors Monoclonal Antibody Titer from Cell Cultures, Agilent Technologies Application Note 5991-2990EN, 2014