Quantitation of 8 Nitrosamines in 12 different solvents by LC-MS/MS system

Význam tématu

Stanovení N-nitrosaminů je klíčové z hlediska bezpečnosti farmaceutických surovin a finálních produktů. Tyto látky patří mezi silné karcinogeny a jejich přítomnost v rozpouštědlech používaných při výrobě API (aktivních farmaceutických látek) je přísně regulována. Regulace EMA stanovuje maximální limity nitrosaminů na úrovni 0,03 ppm, proto je nutné vyvíjet citlivé, robustní a univerzální analytické metody, které zajistí spolehlivé monitorování kontaminace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo vyvinout jedinou LC–MS/MS metodu pro simultánní kvantifikaci osmi N-nitrosaminů ve dvanácti běžně používaných rozpouštědlech. Metoda má splňovat regulační požadavky EMA (0,03 ppm) a být rozšiřitelná na další typy rozpouštědel. Studie představuje vhodné postupy vzorkování, kalibrace a validace analytického systému.

Použitá metodika

Pro přípravu vzorků byly na základě fyzikálně-chemických vlastností rozpouštědel aplikovány tři přístupy:

• Directní injekce: voda, metanol, ethanol, acetonitril, isopropylalkohol (IPA), DMSO
  Lineární standardy 1–100 ppb ve vodě (DMSO standardy v DMSO), objem injekce 4 µl.
• Evaporační metoda: dichlormethan, acetone, chloroform, ethylacetát
  Přidání glycerolu a metanolu, odpaření při 40 °C po dobu 40 min, rekonstituce ve vodě, objem injekce 10 µl.
• Metoda ředění: toluen, dimethylformamid (DMF)
  Ředění vzorku metanolem (1 mL vzorku + 2 mL metanolu), objem injekce 4 µl.

Použitá instrumentace

Pro separaci a detekci byla použita soustava:

• UHPLC Nexera XS s kolonkou Shim-pack GIST C18-AQ (100 × 4,6 mm, 3 µm) při 40 °C
• Triple kvadrupólový LC–MS/MS Shimadzu LCMS-8045 s APCI zdrojem (interface 350 °C, desolvace 200 °C, blok 200 °C, nebulizační plyn 3 L/min, sušící plyn 5 L/min)
• Gradientní eluce mobilní fází A (0,1 % kyselina mravenčí ve vodě), B (0,1 % kyselina mravenčí v methanolu), průtok 0,7 mL/min
• Masové přechody MRM pro osm nitrosaminů a čtyři izotopované interní standardy

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární kalibrační křivky v rozsahu 0,001–0,100 ppm (R² > 0,993). Meze kvantifikace (LOQ) se pohybují mezi 0,001 a 0,010 ppm, závisle na nitrosaminu a typu rozpouštědla. Pro většinu kombinací bylo dosaženo procentuálních recoverií v rozmezí 80–120 %. Výjimkou byly některé sloučeniny ve vysoce apolárních rozpouštědlech (toluenu, DMF), kde bylo nutné využít ředění či uvažovat alternativní metody (GC–MS).

Přínosy a praktické využití metody

• Univerzální metoda pro osm nitrosaminů v různých matricích rozpouštědel
• Splnění regulačního limitu EMA 0,03 ppm s dostatečnou citlivostí a přesností
• Zkrácení času analýzy díky rychlé separaci a vysoké průtokové rychlosti
• Možná rozšíření metody na další rozpouštědla mimo testovaných dvanáct

Budoucí trendy a možnosti využití

V budoucnu lze očekávat rozšíření metodiky na nové typy rozpouštědel, včetně vysoce apolárních a aromatických látek. Automatizace přípravy vzorků a on-line spojení s UHPLC–MS/MS může dále zvýšit propustnost a reprodukovatelnost. Integrace vysoce rozlišovací hmotnostní spektrometrie (HRMS) by pak umožnila detekci neznámých nitrosaminů a nechtěných vedlejších produktů syntézy.

Závěr

Vyvinutá LC–MS/MS metoda na systému Shimadzu Nexera XS – LCMS-8045 poskytuje spolehlivou, citlivou a rychlou analýzu osmi nitrosaminů ve dvanácti běžných rozpouštědlech. Metoda splňuje aktuální regulační požadavky EMA a je vhodná pro rutinní kontrolu kvality farmaceutických surovin.