Advancing Research with the SARS-CoV-2 LC-MS Kit (RUO)

Význam tématu

Detekce a kvantifikace SARS-CoV-2 v klinickém výzkumu umožňuje sledovat virovou nálož, porozumět dlouhodobému vylučování viru a vyvíjet prognostické biomarkery. Přímá analýza nukleokapsidových peptidů bez potřeby PCR zesílení rozšiřuje možnosti multiplexních studií a zvyšuje robustnost měření.

Cíle a přehled studie

Studie si kladla za cíl ověřit výkonnost SARS-CoV-2 LC-MS Kit (RUO) pro přímou detekci tří NCAP peptidů v komplexním vzorku (VTM). Hlavními parametry bylo dosažení lineární odezvy v rozsahu 3–50 000 amol/µl, stanovení dolní kvantifikační meze (LLoQ) a posouzení opakovatelnosti in-tra a inter-denního měření.

Použitá metodika

Vzorky ve VTM byly denaturovány a tráveny trypsinem za standardizovaných podmínek. Po přidání stabilně značených interních standardů proběhla imunomagnetická enrichmen­tace SISCAPA pro selektivní zachycení peptidů AYNVTQAFGR, NPANNAAIVLQLPQGTTLPK a ADETQALPQR. Po promytí a elučním kroku byla koncentrovaná peptidová směs připravena k UPLC-MS/MS analýze.

Použitá instrumentace

• Andrew+ Pipetting Robot s cloudovým softwarem OneLab pro automatizaci přípravy vzorků
• ACQUITY UPLC I-Class FTN se vzduchem temperovanou kolonkou Premier Peptide BEH C18 (2.1×30 mm, 1.7 µm)
• Xevo TQ-XS Triple Quadrupole Mass Spectrometer v režimu pozitivní ESI
• Softwarové nástroje MassLynx v4.2 a TargetLynx XS pro akvizici a kvantifikaci

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární kalibraci od 3 do 50 000 amol/µl s r2 > 0,99 při 1/x2 vážení. LLoQ 3 amol/µl splňovalo kritéria přesnosti (<20 % CV) a signál/šum >10. Intra- a inter-denní opakovatelnost byla ≤17,4 % CV napříč celým kalibračním intervalem. QC vzorky zůstaly stabilní na autosampleru při 10 °C po dobu 48 h.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza s cyklem cca 2 minuty pro separaci a detekci peptidů
• Vysoce citlivá a selektivní kvantifikace bez PCR zesílení
• Automatizace minimalizuje ruční zásahy a chybovost
• Možnost paralelního sledování virových markerů a dalších biochemických parametrů v jediném běhu
• Harmonizace výsledků mezi laboratořemi díky standardizovaným reagens a kalibrátorům

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metody na detekci variabilních variant viru a nových proteinových cílů. Integrace LC-MS dat do bioinformatických platforem pro predikci průběhu onemocnění. Vývoj multiplexních panelů spojujících virové a hostitelské biomarkery. Další zefektivnění automatizované přípravy vzorků a miniaturizace protokolu.

Závěr

SARS-CoV-2 LC-MS Kit (RUO) nabízí robustní a citlivou metodu přímé kvantifikace NCAP peptidů v komplexních matricích. Spojení SISCAPA enrich­mamentu, UPLC-MS/MS a plně automatizované přípravy přináší vysokou přesnost, reprodukovatelnost a potenciál pro široké aplikace v klinickém výzkumu.

Reference

• Fajnzylber J. et al. SARS-CoV-2 Viral Load is Associated with Increased Disease Severity and Mortality. Nat Commun. 2020;11:5493.
• Surkova E. et al. False-positive COVID-19 Results: Hidden Problems and Costs. Lancet Respir Med. 2020;8(12):1167–1168.
• Cardozo KHM. et al. Establishing a Mass Spectrometry-Based System for Rapid Detection of SARS-CoV-2. Nat Commun. 2020;11(1):1–13.
• Van Puyvelde B. et al. Cov-MS: A Community-Based Template Assay for Protein Detection in SARS-CoV-2 Patients. JACS Au. 2021;1:xxx–xxx.
• Renuse S. et al. Development of Mass Spectrometry-Based Targeted Assay for Direct Detection of SARS-CoV-2. medRxiv. 2020.